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1、共表达磷脂酶C促进葡萄糖异构酶在大肠杆菌中的胞外表达姜琪 宿玲恰 吴敬 陈晟（江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122）摘要:磷脂酶C（PLC）能够水解细胞膜主要成分磷脂，使细胞膜通透性增强，从而能够释放出胞内物质。本研究构建了PLC与天然胞内定位蛋白葡萄糖异构酶（GI）共表达的重组大肠杆菌，摇瓶发酵胞外上清液中GIC酶活达到3.4UmL-1，占胞外和胞内总酶活的93%，表明GIC成功实现了胞外表达。将胞外上清液中的GIC进行分离纯化和酶学定性，发现其比活为12.1Umg-1，最适反应温度为80，最适pH为10，均与对照菌单独表达的GIO性质基本一致。在此基础上，对上述
2、重组菌进行3L发酵罐培养，发酵周期为24h，酶活达到17.7 UmL-1，表明其良好的工业化放大生产前景。关键词：磷脂酶C，葡萄糖异构酶，共表达，胞外表达与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统作为目前研究最深入和应用最广泛的表达系统具备遗传背景清晰、细胞结构简单、蛋白表达效率高、培养周期短、操作简便等天然优势。是规模化制备重组蛋白的首选表达系统之一1,2。大肠杆菌具有两层细胞膜结构，这一特点决定了蛋白的定位方式除了膜定位外通常分为胞内定位、周质空间定位和胞外基质定位。重组蛋白分泌至周质空间或者胞外基质比定位于胞内更有助于蛋白折叠、减少包涵体的形成、降低胞内杂蛋白的污染以及简化下游分离提取过程，而
3、胞外基质定位蛋白的分离过程只需离心过滤除去细胞即可，在大规模生产生物制品中具有较大优势。3,4对于胞内蛋白来说，通常连接信号肽也无法利用宿主菌蛋白转运系统实现胞外分泌，因此只能通过破碎细胞来获取。常用的方法有机械法，包括高压匀浆破碎、超声波破碎等；非机械法，包括渗透压冲击破碎、冻融破碎，另外还有化学法破碎等。此外，还有研究者采用共表达一些噬菌体来源的溶解细胞蛋白实现蛋白的释放5,6,7。这些使细胞完全裂解破碎的方法在过程中无法避免的释放出细胞内蛋白质、核酸、多糖等杂质，这些杂质会给下游的分离提取过程带来不利影响。本实验室前期研究8表明角质酶具有磷脂酶B的水解活性，当其在胞内重组表达时能够有限的
4、水解细胞膜磷脂组分，在一定程度上对细胞膜形成破坏，提升其通透性，从而使内容物能够非正常释放，但不会引起细胞裂解，因此能够通过与角质酶共表达实现胞内目的蛋白胞外表达的目的。然而，由于角质酶催化磷脂水解的作用位点为磷脂分子中1位和2位酯键9，其产物之一是溶血磷脂，属于较强的表面活性剂，导致在发酵过程中大量起泡，不利于发酵调控和工业放大。磷脂酶C (phospholipase C，PLC，EC3.1.4.3)，是一种水解甘油磷脂C3位点磷酯酰键生成甘油二酯和磷酸胆碱、磷酸肌醇或磷酸乙醇胺等的水解酶10，有报道11中提到Bacillus cereus来源的磷脂酶C(PLC)同样对细胞存在一定毒性。本实
5、验室前期工作构建了Bacillus cereus来源的磷脂酶C在大肠杆菌中重组表达的工程菌，并且研究表明其同样能够在不引起细胞裂解的情况下通过对细胞膜磷脂的部分水解提升膜透性，并且能够避免利用角质酶促进蛋白胞外表达过程中易起泡的缺陷。葡萄糖异构酶 (glucose isomerase, GI, EC 5.3.1.5)，又称木糖异构酶，能将葡萄糖、木糖、核糖等醛糖催化异构为相应的酮糖12，目前，其主要应用领域为将葡萄糖转化为果糖从而制备果葡糖浆。葡萄糖异构酶来源广泛，包括近百种细菌和放线菌13，其中，绝大部分为胞内酶，研究者在进行其重组表达时通常采取胞内定位的形式。本实验室前期构建了Thermo
6、bifida fusca来源的葡萄糖异构酶在大肠杆菌中重组表达的基因工程菌，并且研究表明其酶学定性和应用性能良好，具备良好的工业化应用潜力14。本研究通过共表达B. cereus来源的磷脂酶C(PLC)和T. fusca来源的葡萄糖异构酶，考察磷脂酶C是否能够通过限制性地破坏细胞膜促使葡萄糖异构酶的胞外“释放”，并考察在这一过程中，葡萄糖异构酶是否发生折叠不正常、性质改变等问题。作者简介：姜琪（1990），女，硕士，研究方向为发酵工程与技术。E-mail：通信作者：陈晟（1981），女，副教授，博士，研究方向为工业微生物、酶工程、发酵工程与技术。E-mail：1 材料与方法1.1 菌株与质粒E
7、.coli JM109、BL21(DE3)菌株、葡萄糖异构酶胞内表达的重组E.coli BL21(DE3)及分别带有磷脂酶C和葡萄糖异构酶基因的重组质粒pETDuet/plc和pET24a/glu为本实验室保藏。 1.2 试剂与培养基限制性内切酶Nde、Xho，碱性磷酸酶（calf intestine alkaline phosphatase, CIAP），T4DNA连接酶，DNA Marker及琼脂糖购于宝生物工程（大连）有限公司；质粒小提试剂盒及琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于天根生化科技有限公司；异丙基硫代-D半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactoside, IPTG)和
8、氨苄青霉素(ampicillin, Amp)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；分子级酵母粉和胰蛋白胨购自英国Oxoid公司；其它试剂均为国产分析纯试剂，购于上海国药集团化学试剂有限公司。LB液体培养基(gL-1)：酵母粉 5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0。LB固体培养基：LB液体培养基中添加1.5%-2.0%的琼脂。TB培养基(gL-1)：甘油5.0，胰蛋白胨 12.0，酵母粉 24.0，K2HPO43H2O 16.4，KH2PO4 2.3。LB(TB)-Amp培养基：在灭菌后的LB(TB)培养基中添加终浓度为100 gmL-1的氨苄青霉素。3 L罐发酵培养基 (gL-1)：甘
9、油 8.0，KH2PO4 13.5，(NH4)2HPO4 4.0，柠檬酸 1.7，MgSO47H2O 1.4，微量元素液 12.0 ml，工业级酵母粉2.4，工业级蛋白胨1.2，调pH 7.0。微量元素液 (gL-1)：FeSO47H2O 10.0，ZnSO47H2O 5.25，CuSO45H2O 3.0，MnSO44H2O 0.5，Na2B4O710H2O 0.23，CaCl2 2.0，(NH4)6Mo7O24 0.1。补料液 (gL-1)：甘油 600，MgSO4 9.0，工业级酵母粉 2.4，工业级蛋白胨1.2。1.3 方法1.3.1 大肠杆菌表达质粒的构建提取本实验室保藏的重组质粒pE
10、T24a/glu及pETDuet/plc，经Nde、Xho双酶切，割胶回收获得glu基因及线性化的pETDuet/plc载体，16连接过夜，转化E.coli JM109感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选。获得的转化子提取质粒经Nde、Xho双酶切验证正确，即质粒pETDuet/plc/glu。将验证正确的pETDuet/plc/glu质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选，-80甘油管保存。1.3.2 重组菌诱导表达将葡萄糖异构酶和磷脂酶C共表达的重组菌（以下简称共表达菌）与葡萄糖异构酶单独表达的对照重组菌（以下简称对照菌）在LB培养基中37、200 rpm
11、min-1振荡培养8-10h，以5%接种量转接至TB培养基中，25、200 rpmmin-1培养6小时后加入IPTG至终浓度为0.1mmolL-1，继续在25、200 rpmmin-1培养至发酵液中GI酶活不再上升。1.3.3 葡萄糖异构酶纯化及SDS-PAGE凝胶电泳检测前处理：将共表达菌发酵液离心收集上清；对照菌发酵液离心收集菌体，菌体用适量30mM磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-KH2PO4，pH7.5)复溶，超声破碎细胞，离心收集上清液。将上述收集的共表达菌发酵上清液和对照菌破壁上清液75处理15min，离心，收集上清液。硫酸铵沉淀：在经过前处理的上清液中缓慢加入70%(w/v)硫酸铵，
12、盐析过夜，8 000 rpmmin-1、4 离心30 min；用适量缓冲液A（30mM Na2HPO4-KH2PO4，pH7.5）将沉淀充分溶解，4 透析过夜，经膜过滤后即为上样样品。DEAE-Sepharose 阴离子交换柱用缓冲液A平衡后上样，依次用缓冲液A、含01 M NaCl的缓冲液A、含1 M NaCl的缓冲液A洗脱结合蛋白，流速为1mLmin-1。收集有酶活力组分进行酶活测定和蛋白电泳分析。1.3.4 酶活力检测方法葡萄糖异构酶活力检测方法以3 molL-1 的葡萄糖溶液为底物，葡萄糖异构酶将底物异构化为果糖，进而采用咔唑-硫酸法测定果糖含量。异构反应为：0.1 mL 的3 mol
13、L-1 葡萄糖溶液，0.1 mL 的50mmolL-1 的MgSO4，0.1 mL 的300 mmolL-1 pH 7.5 Na2HPO4-KH2PO4 buffer，0.6 mL H2O混匀，70 预热5 min，加入0.1 mL 适当稀释的酶液(以水作空白)，准确反应10 min后，立即用1 mL 的0.5 molL-1 HClO4 终止反应。显色反应：将上述反应液稀释一定倍数后取0.5 mL 加入到比色管中，再分别加入0.1 mL 半胱氨酸盐酸盐溶液，3 mL 75%的 H2SO4 和0.1 mL 咔唑-酒精溶液，震荡混匀后置于60 水浴中反应10 min。置于冰浴冷却至室温后，于560
14、 nm 处测定吸光度(空白为以水代替反应液)。酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟生成1 mol 果糖所需的酶量为一个活力单位(U)。1.3.5 重组菌株生长曲线测定从甘油管中接种共表达菌及对照菌于LB培养基中，37、200 rpmmin-1培养8-10h，5%转接量转接于TB培养基中，37、200rpmmin-1培养，定时取样测定OD600nm值及酶活力，实验过程中做2组平行实验。1.3.6 重组GI最适温度及最适pH测定最适温度测定其他条件不变，分别在测定55、60、65、70、75、80、85、90纯化共表达重组GI酶活，以酶活最高的为100%。其他条件不变，分别测定pH5.5pH1
15、2之间的酶活，以酶活最高的为100%。1.3.7 3L发酵罐培养方法从甘油管中吸取100L菌液，接种于含有100 gmL-1氨苄青霉素的工业级LB培养基(装液量50/250 mL)中， 37、200 rpmmin-1培养8h。将种子以10%的接种量接入Infors 3L全自动发酵罐中，初始装液量1.2 L。诱导前培养温度37，pH7.0，溶氧20%。当发酵初始碳源甘油基本消耗完时，开始流加补料液；流加方式为指数流加，比生长速率控制在=0.2 h-115。当菌体干重约为7.5左右时，加入甘氨酸，加量为10 gL-1；菌体干重约为25左右时，开始诱导，诱导方法为恒速流加乳糖，乳糖加量0.2gL-1
16、h-1。开始诱导后，每3h取样一次，测定菌体干重和培养基中酶活变化，培养基中酶活不再上升时，发酵过程结束。2 结果与分析 2.1 重组表达质粒的构建分别提取pETDuet/plc质粒及pET24a/glu 质粒，经Nde、Xho双酶切，pETDuet/plc酶切之后再用CIAP去磷酸化处理以防止自连，目的片段回收后用T4DNA连接酶16连接过夜，转化E.coli JM109感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选。获得的转化子提取质粒经Nde、Xho双酶切验证，得到目的条带（图1），重组质粒pETDuet/plc/glu构建成功。图1 重组质粒pETDuet/plc/glu Nde、Xho双酶切电泳
17、图Fig.1 Restriction enzyme digestion analysis of pETDuet/plc/glu by Nde and Xho2.2 重组葡萄糖异构酶在大肠杆菌中的表达将验证正确的重组质粒pETDuet/plc/glu转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，筛选获得转化子，将该转化子与实验室前期构建的单独表达GI菌株按照上述1.3.2节方法进行诱导培养。结果如图2所示， 共表达菌（以下简称共表达GI为GIC）与对照菌（以下简称单独表达GI为GIO）生长情况相似，在发酵过程的前8个小时，共表达菌培养基中检测不到GIC酶活，推测可能是此时PLC对细胞的破坏作用
18、尚未达到能够使GIC渗漏的程度。发酵过程8小时后，随着时间的增加，培养基中GIC酶活逐渐增加，直至24小时，酶活增加随着时间推移几乎无增长，发酵过程结束，此时培养基中GIC酶活达到3.4UmL-1，胞内酶活约为0.3 UmL-1，GIC总酶活为3.7 UmL-1，因此释放至胞外的酶活约占总酶活的93%。蛋白电泳结果显示，共表达菌培养基上清组分中在43 kD处有明显的条带，与GI理论分子量一致，表明与PLC共表达时GI能够被高效释放到胞外上清基质中。此外，对照菌发酵过程结束酶活达到4.2 UmL-1，共表达菌与对照菌葡萄糖异构酶表达量区别不大。(a)(b)(c)图2 共表达菌和对照菌发酵过程生长
19、和产酶曲线Fig.2 The growth and enzyme production by recombinant E. coli BL21(DE3)(a)共表达菌和对照菌生长曲线；(b)共表达菌胞外酶活变化曲线；(c)对照菌胞内酶活变化曲线 对照菌； 共表达菌图3 共表达菌摇瓶发酵胞外上清液SDS-PAGE电泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombination M，蛋白质分子量标准；1，对照菌发酵培养基上清组分，诱导IPTG浓度0mgmL-1；2，共表达菌发酵培养基上清组分，诱导IPTG浓度0 mgmL-1；3，对照菌发酵培养基上清组分，诱导IPTG浓度0
20、.4 mgmL-1；4，共表达菌发酵培养基上清组分，诱导IPTG浓度0.4 mgmL-1；2.3 重组蛋白的纯化及定性当GI与PLC共表达时，PLC破坏细胞膜，GI被释放到培养基中的过程是细胞非自然生长状态下渗漏的结果。在这一过程中，可能伴随着GI折叠不完全、结构松散、酶学性能改变等现象。为了考察这些现象是否存在，对GIC进行了分离纯化，并检测了最适温度、最适pH、比活等性质，与实验室保存的GIO纯品性质进行比较。根据前述1.3.3节方法对粗酶液进行分离纯化。经历了2步纯化后，如图4所示，达到电泳纯。如表1所示，最终获得纯酶GIC比活11.9 Umg-1，与本实验室纯化GIO比活12.1 Um
21、g-1相近。图4纯酶GICSDS-PAGE电泳图Fig. 4 SDS-PAGE analysis of purified GIC1，共表达菌发酵培养基上清样品；2，共表达菌发酵培养基上清硫酸铵沉淀透析后样品；3，阴离子交换层析后样品；M，蛋白质分子量标准表1 GIC纯化过程参数Table 1 Purification scheme of recombinant GICGIC纯化步骤总蛋白含量（mg）总活力（UmL-1）比活力（Umg-1）纯化倍数得率（%）粗酶液18.874.54.01100硫酸铵沉淀6.235.85.81.548.0阴离子交换0.647.611.93.010.2获得GIC纯酶
22、后，分别测定GIC和GIO纯酶最适温度和最适pH，分别选择温度范围5590和pH范围5.512进行实验，结果如图5所示：GIC最适温度为80，最适pH为10.0，与GIO一致。且二者随着温度和pH值变化，残留酶活百分比趋势基本一致。（a）（b）图5 （a）GIC和GIO最适温度（b）GIC和GIO最适pHFig. 5 Effects of temperature and pH on activity of GIC and GIO GIC； GIO与磷脂酶C共表达的葡萄糖异构酶和单独表达的葡萄糖异构酶在比活、最适温度、最适pH等性质方面没有明显差别，表明在共表达的过程中，葡萄糖异构酶在被释放出细
23、胞前已经正确地完成了整个蛋白合成过程，并且不存在折叠不完全等异常情况。2.4 磷脂酶C与葡萄糖异构酶共表达菌株3L罐小试为了考察葡萄糖异构酶与磷脂酶C的共表达是否能够应用于工业生产的放大潜力，用菌株pETDuet/plc/glu进行3L发酵罐培养。按照1.3.7节所述方法进行pETDuet/plc/glu菌株的3L罐小试。接罐后约6.5h，培养基中的甘油耗尽，开始补料。采用指数流加法进行流加补料，细胞干重约为25 gL-1时，开始流加乳糖诱导。诱导开始后，每3h取样一次。结果如图6所示：培养基中的酶活和细胞干重随着诱导时间的延长逐渐增加。当乳糖诱导约为18h时，细胞干重不再明显增加；当乳糖诱导
24、约为24h时，培养基中酶活不再明显增加，此时酶活达到了17.7 UmL-1，是摇瓶发酵菌株培养基酶活的5.2倍，释放到培养基中的酶活比例约为85%。电泳结果如图7所示。（a）（b）图6 3L罐小试菌体干重变化和产酶曲线Fig.6 The growth and enzyme production by recombinant E. coli BL21(DE3) under the fermentation condition 培养基中的GIC酶活， 细胞中的GIC酶活图7 3L罐小试GIC蛋白电泳图Fig.7 SDS-PAGE analysis of extracellular fraction
25、 under the fermentation condition本研究中对重组磷脂酶C和葡萄糖异构酶共表达的菌株进行的摇瓶发酵和3L罐小试结果说明，葡萄糖异构酶成功实现了胞外表达，并且这一过程具有表达效率高、发酵过程易调控、后期分离纯化简便等优势，有利于工业化制备葡萄糖异构酶。3 展望本研究通过共表达对细胞膜有伤害作用的磷脂酶C成功实现了天然胞内蛋白葡萄糖异构酶的胞外表达，并且获得了较高的表达效率。然而过程中的一些实验条件包括发酵条件等只是初步的探究，并未进行深入的优化，仍然存在进一步发掘的潜力。在未来的研究中，可以进一步优化实验工艺，尤其是发酵工艺，以获得更高的胞外酶活、更好的分泌效率以及
26、更短的发酵周期等，为葡萄糖异构酶工业化规模制备奠定基础。参考文献1 Yoon S H, Kim S K, Kim J F. Secretory production of recombinant proteins in Escherichia coliJ. Recent Pat Biotechnol, 4(1): 23-29.2 Jong W S P, Sauri A, Luirink J. Extracellular production of recombinant proteins using bacterial autotransportersJ. Curr Opin Biotech,
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34、g the Extracellular expression of Glucose Isomerase in E.coliJIANG Qi, SU Ling-qia, WU Jing, CHEN Sheng(State key laboratory of food science and technology, JiangNan University, Wuxi 214122,China)Abstract：Phospholipase C (PLC) could hydrolyze the phospholipids in the membrane. The hydrolysis was par
35、tial, which would enhance the cell membrane permeability, and then proteins in the cytoplasm were released into culture medium. In this laoratory, PLC was co-expressed with glucose isomerase (GI). In shake flask fermentation of recombinant E. coli BL21 (DE3), the activity of GIC in culture supernata
36、nt was 3.4UmL-1, which was 93% of the total enzyme activity in culture supernatant and cytoplasm. GIC was released into culture medium. We purified the GIC and characterized it. The specific activity of GIC was 12.1Umg-1; the optimum temperature was 80, and the activity of GIC was maximal at pH 10. The characteristics of GIC were similar to GIO. Utilizing fed-batch strategy in 3L fermentor, the enzyme activity reached 17.7 UmL-1 in 24 hours.Key words: Phospholipase C, Glucose isomerase, co-expression, released into culture medium