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1、黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因cDNA片段的克隆及表达分析南京农业大学2010,33(1):3742Jorualo厂Na.jingAgriculturalUniversity魏跃,陈啸寅,李振陆,等.黄瓜6一磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因cDNA片-衩Jt的克隆及表达分析J.南京农业大学,2010,33(1):3742黄瓜6一磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因cDNA片段的克隆及表达分析魏跃一,陈啸寅,李振陆,王永平,史建磊,吴志明,张蜀宁,陈劲枫(1.南京农业大学农业部南方蔬菜遗传改良重点开放实验室,江苏南京210095;2.江苏农林职业技术学院,江苏镇江212400)摘要:以黄瓜品种露丰为材料,根据已报道的6
2、磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH)的保守氨基酸序列设计简并引物,利用RTPCR技术获得黄瓜6PGDH的cDNA同源片段,命名为CSPG(登录号为EU815934)该片段长度为1207bp,包含一个936bp的开放阅读框(编码311个氨基酸)和271bp的PolyA3非翻译区末端,无内含子;该基闪编码的氨基酸序列拟南芥,大豆,水稻,玉米,菠菜的6PGDH基因有75%以上的同源性.运用半定量RTPCR技术对6PGDH基因的转录水平进行分析,结果表明:该基因在叶,根,茎中均有表达,高温胁迫下的表达量高于常温对照,说明6PGDH基因与热胁迫相关.关键词:黄瓜;6磷酸葡萄糖酸脱氢酶;eDNA;克隆中图
3、分类号:$642.2文献标志码:A文章编号:10002030(2010)【)l一003706Cloningof6-ph0sph0gluc0natedehydrogenasegeneeDNAfragmentsfromcucumberandexpressionanalysisWEIYue,CHENXiaoyin,LIZhenlu,WANGYongping,SHIJianlei,WUZhi.ruing,ZHANGShuning,CHENJin.feng(1.KeyLaboratoryofSouthernVegetahleCropGeneticsImprovement,MinistryofAgricu
4、lture,NanjingAgricuhuralUniversity,Nanjing210095,China;2.JiangsuPolyteehniealCollegeotAgricultureandForestry,Zhenjiang212400,China)Abstract:WithhomologybasedPCRstrategy,afragmenteDNAnanledCSPG(accessionnumberEU815934)wasclonedfromCucumissativuslufeng.ThelengthofCSPGwas1207bp,whichencompassedanopenre
5、adingframe(ORF)with936hpencoding311aminoacidresiduesand271bpnontranslation3terminalendregion,andnointronexistedinCSPG.TheproteinencodedbyCSPGwasnlorethan75%highlyhomologous6-phosph0g1uconatedeh)rdrogenasegene(6PGDH)ofArabidopsisthali一(Hla,Glycinemax,Oryzasativa,Zeamays,inaciaoleracea.Theexpressionof
6、6PGDHwasanalyzedbysemiquantitativeRTPCRindicatingthaithegenehadexpressioninleaf,rootandstein,andthattheamountofexpressionwashigherinheatstressthannormaltemperature.Whichshowedthatexpressionof6PGDHwasrelatedtoheatstress.Keywords:CucumissativusL.;6PGDH;cDNA;clone植物戊糖磷酸途径(phosphatepentosepathway,PPP)是细
7、胞中重要的初生代谢途径,具有重要的生理功能,6一磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)是戊糖磷酸途径的一个限速酶,关键酶,它可将6一磷酸葡萄糖酸脱羧转变为5一磷酸核酮糖并且产生NADPH.当植物受到重金属毒害J,盐胁迫,病毒侵害等胁迫时,6PGDH基因的表达与酶活性会显着增强,6PGDH基因已经从玉米(Zeamays(AF061838),大豆(Glycinemax(AB007907),苜蓿(Medicagosativa(U18239)6,拟南芥(Arabidopsisthaliana(AY084486)H,菠菜(Spinaciaoleracea(AF295670),水稻(OryzasativaAY2
8、78362)等中分离,但在黄瓜上还未见报道.本研究旨在克隆黄瓜6PGDH基因并研究该基因在逆境胁迫下转录表达的变化,为将来利用基因工程提高黄瓜对逆境胁迫的适应能力奠定基础.收稿日期:20081029基金项目:国家自然科学基金重点项日(30830079);国家自然科学基金项目(30671419,30700541);国家863项经费项目(2008AA10ZI50,2006AA100108作者简介:魏跃,博士研究生通讯作者:2006AA10Z108);教育部1l1计划项目(B08025)陈劲枫,教授,博导,主要从事蔬菜遗传与育种研究38南京农业大学第33卷1材料与方法1.1试验材料供试材料为南京农业
9、大学黄瓜课题组提供的黄瓜耐热品种露丰(CucumissativusLufeng).将种子播种于灭菌基质中并放置于人工气候箱中培养,温度为38,对照培养温度为28,每日光照均为14h,幼苗长至23片真叶时取嫩叶,根,茎.MMLV反转录酶,pMD19一T载体,Taq酶均为TaKaRa公司产品,大肠杆菌TOP10为本实验室保存,Trizo!为美国比太克公司生产.1.2方法1.2.1DNA,RNA的提取与反转录黄瓜叶片DNA提取采用CTAB法,RNA提取采用Trizol试剂法_J】,分别提取嫩叶,根,茎的总RNA,以Oligo(dT)5一GACTCGAGTCGACATCGArr1兀咖.rITITI13
10、.为反转录引物,MMLV反转录酶合成cDNA.1.2.2目的基因片段的克隆及分析1)6PGDH基因3末端片段的扩增.参照拟南芥,水稻,大豆等的6PGDHcDNA序列比对后的保守氨基酸序列,设计上游简并引物sl:5GcNTGGMGNMGNGTNGTNGG.3,以反转录引物Oligo(dT)为下游引物,以cDNA为模板进行2次PCR扩增.PCR反应体系为2O,其中含有10xPCRBuffer2.0txL,模板cDNA1txL,200txmol?LdNTP1.6L,2.0mrnol?LMgC1,1.6,0.5mol?L.上下游引物各1I,1UTaq酶0.2txL,ddH2O11.6.第1轮扩增条件为
11、:94oC3rain;9430S,45oC30S,72oC1min,35个循环;7210rain,4保存;第2轮PCR扩增以第1轮PCR产物为模板,退火温度提高至50,其余条件相同.2)6PGDH基因中问片段的扩增.根据NCBI数据库中拟南芥,水稻,大豆等的6PGDHcDNA序列比对后的保守氨基酸序列,设计上游引物s2:5一GGNAAYTIGTNAARATGGT一3,根据已得到的3末端片段序列设计下游引物A2:5一CTGCTATCTACTCCCCTAA一3,分别以cDNA,DNA为模板进行PCR扩增.反应体系同上,条件为:943min;9430S,50oC30S,72oC1.5rain,35个
12、循环;7210min,4保存.3)目的片段的回收,克隆及分析.回收的目的片段连接到pMD19一T载体上,连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10,进行蓝白斑筛选,挑取白斑接种于1mLLB(含100mg?L氨苄青霉素)液体培养基中.温度37CC,150r?min一振荡培养过夜.在相同条件下进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测插入片段的大小.序列测定由上海博亚生物科技公司完成,在NCBI站点进行BLAST相似性比对,利用DNAman软件进行多序列比对及同源性分析.1.2.3高温胁迫下6PGDH在不同器官中的表达根据已得到的CSPG序列设计上游引物s3:5一cTAGccrrrGccTA邝TcG一3,下游引
13、物为A2(同上),预计扩增长度为341bp,以actin为内标调整叶,根,茎cDNA模板浓度,进行6PGDH基因mRNA的半定量表达分析.2结果与分析2.1黄瓜6PGDH基因克隆2.1.1黄瓜6PGDH基因3端的克隆以叶片cDNA为模板,用简并引物s1和Oligo(dT)对其进行2次PCR扩增,结果扩增出在300600bp较亮的弥散条带(图1).PCR产物纯化后与pMD19一T载体M1MlhP600500400300图lRT-PCR的弥散扩增产物Fig.1SmearproductofRT-PCRM.DI1000DNA标准分子质量DL1000marker;1的弥散扩增产物Smearproduc|
14、ofRT.PCR图2重组质粒的PCR分析Fig.2PCRanalysisoftherecombinantplasmidsRT.PCRM.DL1000DNA标准分子质量DL1000marker;1.重组质粒的PCR产物PCRproduc|ofrecombinantplasmids第1期魏跃,等:黄瓜6一磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因cDNA片段的克隆及表达分析39连接,连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10,经蓝白斑筛选后,以纯化的阳性重组质粒为模板,以引物S1和Oligo(dT)进行PCR扩增检测和分别测序,从中筛选出含有与拟南芥,水稻,大豆等6PGDH氨基酸序列同源性高于75%的511bp片段/1_的
15、重组质粒(图2),该片段末端含有l5bp的PolyA结构,表明所克隆片段是目标片段的3端(图3).GClTGGAGGAGAGTCGTGGGGT1GGCCATATCGGCAGGGATCAGCA(GQ垒I至TG(T_AGCCTTGCCTATTTCGACACATACAGGCGTGCTAGGCTGCCTQATCI工工鱼CAGGCGCAAAGAGACTTATTTGGG(jCTCATACATATGAaCGGGTGGATCGCCAf!ACCACACAGAGTGGACAAAGCTGGCTcGCAQTGCTGA_GCTGQ0TTGQ!ICAACTGAGCCTTTGAGCTGCCTACCAATTTGGCTGGTT
16、TTCTTTCTCTGCTTCA_r工(jTG(AAATTTCCTACTTGATTTTGCTT【jCCCATTTCAAAAGT下AGTAGGTTTTCT!工!r王!鱼III!Ir至垒!I工Q王鱼ATAATTTTTACTGGCCTTGAGTLTTTGCTATGAATAATAATTAATAAGGAAAAAACAAGAAAGAAGCAACAGCTGCAGAATGGCCATTGAGTTCAAAAAAAAAAAAAAA图36PGDH的3末端核苷酸序列Fig.33endnucleotidesequencesof6PGDH阴影部分为终止子密码,下划线为与中问片段克隆的蓖叠区域superposedfiledw
17、ithmiddlefragment2.1.2黄瓜6PGDH基因中间片段的克隆分别以叶片eDNA,DNA为模板进行扩增都得到长度约1100bp左右的条带(图4),测序结果显示2条片段序列完全相同,且与图3的6PGDH基因3末端序列有402bp的重叠区(图5),说明克隆为目标片段且该片段内无内含子存在.2.2cDNA序列生物信息学分析将2个片段进行拼接,获得1个长度为1207bp的cDNA片段,包含936bp编码311个氨基酸的开放阅读框(ORF)和含有271bp非翻译区(UTR)PolyA3hp5002000()0Mandtheunderlinedpartwas2图46PGDH基因的PCR扩增结
18、果Fig.4Theelectr0ph0resisresultsof6PGDHgenePCRproductsM.DI3000DNA标准分子质量DI300DNAtnarker;t.以eDNA为模板的PCR片段PCRproductotcDNA;2.以DNA为模板的PCR片段PCRproductotDNAGGGAATTTTGTGAAGATGGTGCATAATGGTATTGAATATGGTGATATG(AGCTCATTT(G(jAGGCCTACGACGTTTTGAAACGTGTCGGAGGGTTGTCCAATTCCGAATTGGCTGACATTTTCTCTGAGTGGAACAGGGGGGAGTTGGAG
19、AGCTTTCTAATTGAGATATCAGCTGATAT(TTTAAA(;TTAAAGATGAACATGGTGATGGGGAATTGGTCGA3,AAGATT-ITGGACAAGACTGGGATGAAAGGAACTGGGAAATG(ACTGTGCAGCAAGCTGCTGAGCTTTCCATTGTAGCG(AACGATTGCAGCCTCGTTGGATTGTAGATA(丁TGAGTGGATTGAAGGACGAGAGGGAAA(jTGCGGCGGAGGTGTTGAAGGAAGCAGGTATGACGGATAGTGTAGGATCCGTGAGAAGTGGGATTGACAAGAAGAAGTTGATTGAA
20、GATGTAA(j(j(,AA(CTTTGTATGC(,TCCAAGATTTGCAGCTAFGCTCAGGGGATGAACTTGCTAAGGG(,AAGAGCTTGGA(AAGGGATGGAACTTGAATTTTGGGGAATTGGCGAGGATTTGGAAAGGTGGGTGCATCATAAGAGCTGTGTT(,TTGGACAGGATCAAGAAGGCATATCAG(jCAATCCCAACCTTGCTAGCTTGCT(jGTGGATCCTGAGTTTGCTAGAGAGATGGTGCAGAGGCAGG(,TGCTTGGAGGAGAGTCGTGGGG丁TGGCCATA丁CGGCAGGGA丁CAG
21、CACCC(,GGGGA_rGTGTGCTAGCCTTGCCTATTTCGACACATACAGGCGTGCTAGGCTGCCYGCAGTTGGCATTTTCAACTGAGCCTrrTGAGCTGCCTACCAATTTGGCTGGTTTTCTTTCTCTGCTTCAATTGGGTGCAAATT11CCTACTTGATTTTGCTTGCCCATTTCAAAAGTTAGTAGGTTTT(TTTTTTGTATCACAGTTTGGACAGTCTTC(,ATGCTTCTTAGGGGAGTAGATA图56PGDH基因中间片段的核苷酸序列Fig.5Middlenucleotidesequencesof6PGD
22、H阴影部分为引物,下划线为j3末端克隆的重叠区域_rheshadedregionwasthefJritnet1efiledwith3endfragmm1tadtheunderlined)artWaSsuperposed南京农业大学第33卷末端,用NCBI的BLAST和DNAman软件进行序列对比及同源性比较,结果表明:编码的氨基酸序列与拟南芥,菠菜,水稻,玉米,大豆,苜蓿等的6PGDH基因氨基酸序列同源性较高,分别为86.8%,83.3%,78.8%,77.4%,75.7%,74.9%(图6),推测该片段为黄瓜6PGDH基因序列,命名为CSPG(GenBank登录号为EU815934).拟南芥
23、AntbM(isthaliana水稻O<yzasatia条斑紫菜)mhyrazJens玉米Zeamays菠菜5pinaeiaf)rflCefl大豆GIv(,imax苜蓿Medicagosatia黄瓜iCiltnissa6s一敛序列Consens11S拟南芥Aral>Mo1)sisthaliana水稻O0,zasati条斑紫蒙PolT*hyrayezoensis玉米ama菠菜5pinacia0jmP月大豆Glvcinemd菖蓿MedicagJativa黄瓜Cucumi+satis一敛序列Collsensis拟南芥AnlbidopsisthMiana水稻On,zasaliva条斑紫荣P
24、orpbyrayezoensis玉米Zeamztys菠菜,qpinaeiaoel8oe8火Gly(_,JY苜蓿Medicagosativa黄瓜Cncumissailvs一敛序列CllnseIS拟南芥Ambiristhaliana水稻Oryzasailva条斑紫菜Porphyrayezoensis玉米Zea/flays菠菜s,)inwiaoleracea大豆Gly<-inemHx苜蓿Medicagosativa黄瓜Cu<:mnissalis拟南芥4rahidopsisthaliana水稻Oryzasaliva条斑紫荣Porphym.vzoeHsis玉米ZmaVs菠菜SpinafnJf
25、a大豆Glyr-inmY苜蓿Me<licagosativa黄瓜CucumissatiIIS一敛序列ConsensIls拟南芥Azabidopsisthaliana水稻Orvz1saliva条斑紫菜Potphyn.vezoensis米Ill菠菜Stinaciaoleraeea大豆Ghineax菖蓿Medi(agosativa黄瓜Cueumissalis一致霄鳓ConsensxbfVb胃VngjeygqliseaydvikvggisnseavfewnkgelesflieitadigdgLvdkiidktvkgtgkwtvqqaaesvaaptiaasdrylsg!kdvi.ainagistp
26、gmsasayfdtyKrripanlVqaqrdyf广jahtyerV<量pgsyhtewIKlARKSQ.?WLARKSNG?4j,SSj嚣VTE7.F嚣董RNiS.S鞲RKS0p;A?饕jF嚣薹魏0S蔓:YCSi舀.硪热l鼻.:,ll图6不同物种6PGDH氨基酸序列同源性比较Fig.6Alignmentofpredictedaminoacidsequencesof6PGDHfromdifferentspecies300287159298342300300l17360346217353402358358l774204O62774134624l84l823748647734648253
27、64924%3l1拼m研聊第1期魏跃,等:黄瓜6一磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因cDNA片段的克隆及表达分析41应用DNAman软件将推测的黄瓜6PGDH氨基酸序列和从GenBank中获取的其他植物氨基酸序列进行系统树分析,发现黄瓜与拟南芥最先聚类,说明与拟南芥在进化上靠得最近,接着与菠菜,水稻,玉米,大豆,苜蓿聚类,与条斑紫菜在进化上的亲缘关系最远(图7).l00%90%80%70%60%50%123M456渣菜iaolelTtJ大可(Tlvii苜蓿Meragosati条斑紫菜PorldOmvf!zo(fflsiq图7不同物种6PGDH氨基酸序列的系统树分析Fig.7Phylogenetictree
28、ofthededucedaminoacidsequenceof6PGDHindifferentspecieslJ】500400300图8不同器官中6PGDH基因的半定量RTPCR表达分析图谱Fig.8Theexpressionmapof6PGDHgeneindifferentorgansbysemi-QRT?PCRM.DI1000DNA标准分子质量DI1000marker;1,2,3分别为高温胁迫的叶,根,茎l,ear,rootandstemundmheatstress;4,5,6.分别为常温对照的叶,根,茎l,eaf,rnotands|emundernomMtetnperatule2.36P
29、GDH基因的半定量表达分析以组成型表达基因actin为内标,运用半定量RTPCR技术对6PGDH基因在高温胁迫和常温对照下叶,根,茎中的表达水平进行分析,发现高温胁迫和常温下3种器官中该基因均有表达,高温胁迫下6PGDH表达量高于常温对照(图8).3讨论根据高度保守的氨基酸序列设计简并引物,利用RTPCR方法进行克隆是一种简便快速获得目的基因的方法,但对引物的特异性要求较高.本试验设计了2对引物,其中1对的下游引物是根据tuRNA3末端的PolyA特点设计的,结果获得的序列3末端有15个连续A,表明可通过设计适当的引物利用RTPCR直接获得3末端序列,而不需要购买昂贵的试剂盒.2对引物具有40
30、2bp的重叠区域,测序结果表明PCR扩增所得到的2条序列确实具有402bp的重叠区域,说明了分段克隆目的基因的可行性.林善枝等研究了低温胁迫下PeP途径中多种酶活性的变化,经相关性分析表明低温锻炼中酶活性的增加可使PeP的效率提高从而增强植株对低温的适应性.朱雪竹等发现小麦在铝盐胁迫下通过消耗较多的葡萄糖形成还原力NADPH,增加能量消耗以抵消铝胁迫.侯大云研究发现水稻6PGDH的转录水平不同程度地受到高盐,低温,干旱和ABA胁迫的诱导且6PGDH酶活性显着增强,认为水稻的戊糖磷酸途径可能参与植物对胁迫的应答反应,其中6一磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)对提高戊糖磷酸途径的效率起决定作用.本试
31、验结果表明:经38c【=高温胁迫处理6PGDH基因在黄瓜叶,根,茎中的表达量均高于对照,说明该基因与耐热胁迫应答相关,与上述前人的研究结论一致.本研究克隆黄瓜6PGDH基因含3末端序列片段经BLAST比对,发现其编码的氨基酸序列与亲缘关系较远的物种拟南芥,大豆,水稻,玉米,菠菜6PGDH的同源性都达75%以上,说明该基因氨基酸序列具有极高的保守性.目前笔者正准备构建黄瓜6PGDH基因反义表达载体,通过反义抑制表达进一步证实该基因的功能.该片段的成功获得为克隆该基因全长和研究黄瓜戊糖磷酸代谢中相关基因表达转录调控与逆境胁迫相关性奠定了基础参考文献1沈同,王镜岩.牛物化学M.北京:高等教育出版,1
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