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1、实验六 聚丙烯酰胺凝胶 圆盘电泳分离蛋白质,简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理，如何调节凝胶的孔径? 2. 为什么样品会在浓缩胶中被压缩成层？ 3. 为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的40蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蓝各有何用途？ 4. 上下两槽电泳缓冲液电泳后，能否混合存放？为什么？ 5. 根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺垂直板电泳？哪些是关键步骤？ 6. 如何除去凝胶中过量的AP？未反应的单体如何除去？,一、目的要求,1.学习聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳原理和技术 2.学习和掌握圆盘电泳分离蛋白质技术,二、原理 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳和垂直平板电泳具有相同的原理。 不连续： 凝胶孔径不连续性；缓冲体系
2、离子成分及pH值的不连续性；电位梯度的不连续性： 三种效应： 样品浓缩效应；分子筛效应；电荷效应,聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳（左）和圆盘电泳（右）示意图,它们各有什么不同，各自的优缺点是什么？,垂直平板：1、多个样品在同一块凝胶上，电泳条件一致便于利用各种鉴定 方法，直接比较各种样品区带，保证结果的准确可靠2、可以进行双向电泳3、电泳时热量容易消散，凝胶结果便于照相和易于制成干胶圆盘电泳：1、缺点是由于聚合效应，凝胶的长度和直径有细微差别，即使同一 样品在两个凝胶柱上以同样的条件电泳，其结果也会不同2、但是研究工作中还会用到圆盘电泳，例如 测定放射性标记的样品 测定蛋白质的生物活性；测定蛋白质
3、分离的最适pH，凝胶浓度； 双向电泳中第一相的分离。,图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.9 (2)浓缩胶pH6.9 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3,三、试剂的配制： 1、电极Buffer的配制：每排派一个同学配一份 2、样品溶液，染色液都已由实验室的老师配好了。 3、脱色液可在电泳的时候配制,四、凝胶的配制： （1）、分离胶7.5%贮液的配制： A： 称取Tris. 3.7 g；加1.0 mol/L HCL 4.8 ml；TEMED 100 l ；最后加蒸馏水至10ml； pH8.9即可。(TEMED最后在分离胶的混合液中加10 l
4、） B： 分别称取Acr 3.0 g；Bis 0.08 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 C： 称取过硫酸铵(AP) 0.028 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 D： 蒸馏水 分别取：A ：B ：C ：D = 1.0ml ：2.0ml ：4.0ml ：1.0ml （8.0 ml）,（2）、浓缩胶2.5%贮液的配制： E： 称取Tris. 0.958 g；加1.0 mol/L HCL 4.8 ml；TEMED 200 l ；最后加蒸馏水至10. 0 ml ；pH6.9即可。 (TEMED最后在浓缩胶的混合液中加20 l ） F： 分别称取Acr 1.0 g；Bis
5、0.25 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 G： 称取蔗糖4.0 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 H： 称取过硫酸铵(AP) 0.028 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 分别取：E ：F ：G ：H = 0.5ml ：1.0ml ：0.5ml ：2.0ml （4.0 ml）,五、操作步骤 1、分离胶的制备： （1）、将清洁、无破碎干燥的小玻管一端（同学们应该挑选一下比较平的那头），用胶布贴封后，朝下垂直放入有机玻璃凝胶玻管架的孔中，并在小玻管的7.0 cm处作一记号。 （2）、用自动取液器吸取上述配好的分离凝胶贮液沿着小玻管内壁小心准确加入7.0
6、cm高。 （3）、凝胶溶液加毕后，随即吸取蒸馏水，加至管中的凝胶表面，使其表面覆盖一水层（水封，1.0cm 高）。在灌胶和封水的过程中，操作要轻，以避免产生气泡。 （4）、将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正常情况下大约30-60分钟后，待界面出现明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，即可加浓缩胶。,2、浓缩胶的制备： （1）、轻轻倒掉分离胶玻管上端的液体，并用吸水纸吸去未倒净的液体（但不能触及胶面）然后先小心用浓缩胶贮液洗涤凝胶表面1-2次，再小心加入该浓缩胶贮液1.5 cm高。 （2）、随后同样加1.0cm高的蒸馏水层覆盖胶表面。大约也在20-40分钟后，待浓缩胶出现乳白色时，表
7、明胶已聚合完毕。,3、加样： 取一根上次做好的凝胶小玻管用吸水纸轻轻吸去浓缩胶表面上的水层，然后用微量注射器加10ul测试样品溶液。,4、装置凝胶管： 将加好样品的凝胶管的加样端（上端），插入上电泳槽孔中，然后将已插满凝胶管的上电泳槽放入加有电极溶液的下电泳槽内。此时凝胶玻管下端管口易产生气泡，可通过轻轻摆动凝胶玻管以去除气泡，插入上电泳槽的玻管上端，用滴管轻轻滴满电极溶液，以免产生气泡，最后将上电泳槽装满电极液。,5、接通电源： 接通电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，上槽电极接负极，下槽电极接正极，稳压300V电泳开始时，电流应由小逐步加大至额定值。这时的电流大约每管3.0-5.0 mA 电流
8、，直至指示剂前沿到达凝胶管底部约0.5 cm处，（大约需时2小时），停止电泳。确定电泳结束时，不应将溴酚兰跑出凝胶管，以防止标准分子量中的最低分子量蛋白质也跑出凝胶管。,6、练习取出玻管内的凝胶： 将一支带有长针头的注射器吸有适量水（蒸馏水或自来水），把针头慢慢插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，一边开始压水，一边同时使针头慢慢贴紧管壁呈螺旋式前进，如果一端不行，再在管的另一端按同样的方法剥离，这样依靠水流的压力和滑润力，使玻管内壁与凝胶分离，最后用洗耳球在管的一端轻轻挤压，另一端对着一干净大小适宜的培养皿内，此时可以将凝胶柱压出玻管。,7、取出玻管内的凝胶： 8、凝胶染色： 将取出的凝胶柱，放入一
9、合适干净的培养皿内，然后加入适量染色液，于摇床上进行振摇染色30分钟，完毕，回收染色液，用清水洗凝胶柱2-3遍。在染色的同时，凝胶中蛋白质区带亦被固定。,9、凝胶脱色： 在培养皿（或试管）内加入适量脱色液于摇床上进行振摇（2小时/次，需3次）脱色多次直至色带完全清晰为止。,10、绘图： 最后根据染色所出现的带数和位置进行绘图，以确定被分析样品的组分。另一种方法是通过密度扫描仪扫出各组分的峰形位置，这样不仅能确定组分，而且能比较出各组分所占比例（如果要计算出各分离区带的相对迁移率，可参考教课书）。,注意事项,Acr和Bis有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时要注意保护。 没有聚合的丙烯酰
10、胺不要倾倒到水源附近，实验中全部的胶统一放到指定的容器中，由专门的人收集到一起，统一处理。 各种废液请集中在指定的容器中（第一组的水池边的桶）,友情提示: 分 离 胶: 7.0 CM 浓 缩 胶: 1.5 CM 上 样 量: 10 ul 稳 压: 300 V 电泳时间: 1:30 小时 染色时间: 30 分钟 大家在等凝胶聚合的时候，可以观察和记录上次垂直平板电泳的结果。,讨论题,1、在利用预电泳除去未反应完全的单体时，在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶聚合后进行，洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳， 为什么？,讨论题,2、电解液中的离子强度有什么影响？如含大量盐类时，可不可以直接上样电泳 ？为什么？,讨论题,3、实验的上样量是多少，绝对量是多少？可不可以增加上样量，或者说我们的合适上样量是多少？,本次实验做到分离胶和浓缩胶都凝聚后，然后练习取出凝胶。剩余的分离胶和浓缩胶的贮液放到冰箱保存留待下次实验用。,