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1、纯度检测：1.SDS-PAGE测定LDL纯度2.双向免疫扩散测定LDL纯度,含量测定： 1.Folin-酚试剂法测定LDL含量,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析LDL纯度,一、目的要求,1.学习电泳原理和技术 2.学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质技术,电泳概述：,电泳：带电荷的质点，在一定条件的电场作用下，可向一极移动，如带正电荷的质点移向负极，这种现象称为电泳。 影响电泳的主要因素： 1） 电泳介质的pH 2） 缓冲液的离子强度 3） 电场强度 4） 电渗作用 5） 对支持物的选择 6） 温度对电泳的影响 电泳分类： 按原理分：区带电泳、移界电泳、等速电泳、
2、聚焦电泳,二、原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(APS)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的区带电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。,聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： (1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6
3、)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。,凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(RNA) 104 1520 104105 5-10 105-2106 2-2.6,聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与
4、不连续系统两大类。 目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。,图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3,图2 夹心垂直板电泳槽示意图 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝6.上贮槽 7.冷凝系统 图3 凝胶模示意图1.样品槽模板 2.长玻璃板 3.短玻璃板 4.凹形橡胶框,返回,不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由APS催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由
5、APS催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。,不连续凝胶分离蛋白质原理： （1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； 在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离
6、度) 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质； （c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应 (3)电荷效应,图4 电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。,图5 不连续系统浓缩效应示意图,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带
7、电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。,SDS的作用,SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合蛋白质疏水部分，形成SDS-蛋白质复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质。由于SDS带有负电荷，使各种SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质分子原有的电荷和形状的影响，电泳速度只与蛋白质的分子量有关。,蛋白质染色,常用蛋白质染色的几种方法： 1）氨基黑10B 2）考马斯亮蓝R250 3）考马斯亮蓝 G250 4）固绿 5）荧光染料： （l）丹磺酰
8、氯（2，5-二甲氨基萘磺酰氯，简称DNS-Cl）： （2）荧光胺： （3）2-甲氧基-2，4-二苯基-3-呋喃酮（MDPF）： （4）1-苯胺基-8-萘磺酸（简称 ANS）： 6）银染色法 常用脂蛋白染色方法： 1）油红O染色 2）苏丹黑 B,三、试剂与器材 试剂：10%SDS、 分离胶胶贮液（30ACr-0.8%Bis)、分离胶缓冲液（3.0 mol/L pH8.9TrisHCl 缓冲液）、 浓缩胶缓冲液（ 0.5 mol/L pH6.7TrisHCl 缓冲液）、10%过硫酸铵（APS)、 1%四基乙二胺（TEMED）及原液、 pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、 0.05考马斯亮兰R25
9、0染色液 、脱色液、水饱和正丁醇、50%丙三醇 器材：稳压稳流电泳仪、脱色摇床、垂直板电泳槽、电泳槽配件（玻板、T型条、十孔梳、棕色梳、加样指示板）、烧杯、试管、微量移液器、微量进样器,五、 操作方法 1.安装夹心式垂直板电泳槽 (1)旋松固定螺丝并打开电泳槽，仰放在桌面上。 (2)在长、短玻璃板间加T型条，短玻璃板在下放入硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 (3)将电泳槽两侧固定螺丝以对角线的方式旋紧。 (4)竖直电泳槽，在长短玻璃板间加蒸馏水检漏。,2.配胶：SDS-不连续体系凝胶配制,20ml分离胶（7.5%）所需试剂用量（ml） 分离胶胶贮液30ACr-0.8%Bis 5.
10、00 分离胶缓冲液 pH8.9TrisHCl 2.50 10%SDS 0.20 1%TEMED 2.00 双蒸水 10.2 10%过硫酸铵（APS) 0.10 5%浓缩胶所需试剂用量（ml） 分离胶胶贮液30ACr-0.8%Bis 0.65 浓缩胶缓冲液 pH6.7TrisHCl 1.00 10%SDS 0.08 TEMED原液 0.005 50%丙三醇 2.30 10%过硫酸铵（APS) 0.06,3. 制备凝胶板 将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度依据电泳槽标记，约7ml。并在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层水饱和正丁醇(约34 mm)，用于隔绝空气，
11、使胶面平整。 约30-60 min凝胶完全聚合，因聚合过程析出水，可看到胶面增加一条界面线。 将凝胶表面的蒸馏水倒去 ，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.2 cm处，轻轻加入样品槽模板即十孔梳。静置电泳槽，10 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，拔出梳子，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，即可加样。,4. 样品的处理及加样 将样品按0.51 mg/mL加样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸出)，在100沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。 用微量进
12、样器取25 l上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。,5 .电泳 盖上电泳槽盖子，将电泳仪的正极与电泳槽红色连线连接，负极与黑色连线连接，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源。 6 .染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用棕色梳撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，加入染色液染色1 h，再用脱色液脱色过夜，直至蛋白质区带清晰，即可观察蛋白质纯度或计算相对迁移率。,7. 结果观察与处理： 量出加样端距电泳溴酚兰前沿的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与
13、加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR: 相对迁移率mR=,蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm),六、注意事项 （1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝（对角旋紧），避免缓冲液渗漏。 （2）上层浓缩胶聚合快，加入10%APS后快速混匀，及时转移至玻板之间，并快速插入十孔梳，以免样品孔变形。 （3）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。,七、复习题 影响电泳的主要因素有哪些？ 什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳 ？ 聚丙烯酰胺凝胶聚合时自由基的引发有哪两种方法？ 不连续凝胶电泳的分离原理。 请说出常用蛋白质染色的几种方法 。 请说出常用脂蛋白染色方法。 SDS在SDS-PAGE中的作用。 请叙述一下血浆载脂蛋白B-100的分离纯化过程。 蛋白质含量测定方法有哪些？简述其原理。 双向免疫扩散测定LDL纯度原理。,