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1、电泳技术及其在分子生物学中的应用,电泳是带电荷的胶体颗粒在电场中的移动。,净电荷：生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒形式分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度与其他大分子的相互作用。 在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号。,电泳的实现还依赖于支持介质的存在。,电泳的三要素,以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。,琼脂糖凝胶电泳 （agrose gel electrophoresis ） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）,凝胶电泳,用于分离
2、、鉴定和纯化DNA片段,重点内容,影响DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素有哪些？ Western blotting 的基本实验步骤,及每一步的操作意义.,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖（agarose）是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成直径从50nm到略大于200nm的三维筛孔的通道。,凝胶的制备 以琼脂糖为溶质，电泳缓冲液为溶剂，用微波炉加热，配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框，插入梳子，自然冷却。,缓冲液系统 常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼
3、酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L(pH7.57.8)。,含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围,琼脂糖浓度的选择：根据被分离线状DNA片断的大小,样品配制与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有 0.25%溴酚蓝或其他指示染料，,含有10%-15%蔗糖或5% 10%甘油，以增加其比重，使样品集中。,电泳 低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。 因此，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，所用电压不宜高于5V/cm。 cm ：电场正负极间的距离。,染色和拍照 常用荧光染料溴化乙锭（EB）染色，在
4、紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。,琼脂糖凝胶中DNA的染色 荧光染料溴化乙锭（EB） 含有一个可以嵌入DNA或RNA的堆砌碱基之间的一个平面基团 与核酸结合后在紫外线激发下呈现橘黄色荧光，荧光的位置代表核酸片段所在的位置，荧光的强弱代表核酸量的多少,可以检测到少至10ng的DNA条带。 可用于检测单链或双链核酸（DNA和RNA）。,将已知分子量的标准DNA的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知DNA片段在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。,双链DNA分子在凝胶基质迁移的速率与碱基对数目的常用
5、对数成反比。,双链DNA分子在凝胶中的迁移率,影响DNA 在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素 DNA分子的大小 琼脂糖浓度 ； DNA的构象 ：超螺旋环状（I型）、切口环状（II型）和线状（III型）；共价闭环DNA直线DNA开环双链DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA（球形）不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于0。,凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭; 所用的电压 ：低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比；电场强度升高时，高分子质量片段的迁移率遂不成比例的增加； 电泳缓冲液 ：组成和离子强度 。,聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰
6、胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.,与琼脂糖凝胶电泳的比较, PAGE的特点 分辨率很强，长度上相差1bp的DNA即可分开； 从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可适用于要求最高的实验（如胚胎注射）； 装载更多的DNA量； 最适合分离小片段DNA(5-500bp),可以分离蛋白质; 聚丙烯酰胺凝胶一律进行垂直电泳.,假
7、如DNA 顺序中的某个碱基发生了突变，使突变所在部位的DNA 序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。这样，利用该限制性内切酶消化此DNA 时，便会产生与正常不同的限制性片段。这样，在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP)。,限制性片段多态性(RFLP),点多态性实验方法,1.DNA的提取 2.PCR 3.限制性内切酶酶解 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 5.染色,SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳（SDS-PAGE）的原理,在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）
8、， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，同时，在强还原剂（beta-巯基乙醇）作用下，使半胱氨酸之间的二硫键断裂。 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合(多肽和SDS的质量比为1:1.4)，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差异 。,蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。 因此，蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋
9、白质亚基分子量的大小。 当蛋白质分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。,特点 大多在不连续缓冲体系中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液； 不连续缓冲体系具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故提高了SDS-PAGE的分辨力； 系统中所有组分都含有0.1%的SDS。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,负极,积层胶,分离胶,加样孔,正极,考马斯亮蓝染色(0.1-1.0ug的多肽),One-Dimensional SDS-PAGE,Isoelectric Focusing (IEF),等电聚焦电泳的过程 电泳时可将样品置于凝
10、胶的任何位置； 初始位置在负极时，因pHpI，蛋白质分子带负电，电泳时向正极移动；移动过程中，pH逐渐下降，所带负电荷量逐渐减少，蛋白质移动速度减慢；当移动到pH=pI时，蛋白质所带净电荷为零， 蛋白质即停止移动； 各种不同蛋白质在电泳结束后，会分别聚集于相应的等电点位置，形成一个很窄的区带；区带的位置是由pH梯度的分布和蛋白质的pI所决定，而与蛋白质分子的大小和形状无关。,Two-Dimensional SDS-PAGE,PI (by isoelectric focusing IEF),Approximate mol wt. (by SDS PAGE),Example of 2D-Gel S
11、eparation of Proteins,2D gels are ideal tools of protein separation because of their high resolution (1000 spots are commonly visualized on a single gel) and visual readout,Western blotting,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方
12、法，称为Southern印迹法。,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法. 对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法; 对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法.,Western Blotting 基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,1）蛋白提取 2）SDS-PAGE 3）转膜 4）封闭 5）一抗作用 6）标记二抗作用 7）结果检测,Western blotting 基本步骤：,转膜,将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间。,正极 三层滤纸 硝酸纤维素滤膜 凝胶 三层滤纸 负级,转膜后检测,丽春红S染色 预染蛋白marker 考马斯亮蓝染色,封闭: 膜上的空白位点,脱脂奶粉（5） BSA(牛血清白蛋白),一抗、标记二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育，4 过夜。 倒掉一抗溶液，用PBST(或TBST)漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入二抗溶液，摇床上缓慢摇动， 37 2 小时。 倒掉二抗溶液，用PBST (或TBST)漂洗液滤膜3次，每次10min。,结果检测: 二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP）,第一部分完,