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1、第四节 真核生物转录后的加工,多数转录的初始产物无生物活性，在生物体内进行加工处理后才具有生物活性。,转录后加工（ post-transcriptional processing）:,是指将各种前体RNA（Pre-RNA）分子加工转变成有功能的、成熟的各种RNA (mRNA，rRNA或tRNA等) 的过程。,Pre-RNA,Mature RNA,转录后加工的主要方式:,RNA加工修饰主要对象:,hnRNA：mRNA前体 pre-rRNA：rRNA前体 pre-tRNA：tRNA前体,一、tRNA 前体的加工,（一）真核生物tRNA基因结构,真核tRNA的基因成簇排列，基因间有间隔区，是一种重复
2、序列；,前体分子tRNA是单顺反子;,前体分子 tRNA中含有内含子；,前体分子 tRNA中没有3-CCA序列。,（二）tRNA前体的加工,剪接内含子；,柄部结构的加工：加上CCA-OH的3末端，完成柄部结构；,碱基修饰。,（三）tRNA前体的加工过程,1、内含子剪接, 位置相同，都在反密码子环的下游； 不同tRNA的内含子长度和序列各异； 外显子和内含子交界处无保守序列，内含子的剪切是依靠RNase异体催化，进行剪接； 内含子和反密码子配对形成茎环结构，保护了反密码子，使其免受酶的降解。,tRNA内含子特点：,酵母tRNAPhe内含子的结构（引自B. Lewn, 2000）,剪接过程：,第一
3、步：核酸酶切割,释放一条线状内含子 和两个“tRNA半分子”,第二步： RNA连接酶连接断端,切除tRNA内含子的核酸酶很特殊，产生2-3环磷酸和5-OH，因此不能直接连接。3端需通过环磷酸二酯酶（Phosphodiesterase）将2-3环磷酸打开，形成3-OH。5端需在激酶作用下将5-OH磷酸化。再通过连接酶将两个半分子连接起来。哺乳动物的tRNA连接酶可将2-3环磷酸与5-OH直接连接起来。,剪接特点：,(1)真核tRNA内含子的精确剪切不依赖内含子的一级序列和大小，剪切反应的识别信号是 “三叶草” 的二级结构； (2) 不是转酯反应； (3) RNase异体催化剪切内含子。,2、柄部
4、结构加工,- 加上CCA-OH的3末端,tRNA核苷转移酶,tRNA nucleotidyl transferase,3、碱基修饰,（2）还原反应,如：U DHU,（3）核苷内的转位反应,如：U ,（4）脱氨反应,如：A I,如：A Am,（1）甲基化,D臂,反密码子臂,额外臂,TC臂,受体臂,补充：原核生物tRNA 前体的加工,（一）原核生物tRNA基因结构,原核的tRNA初始转录本多为多顺反子（polycistron），少数的tRNA前体为单顺反子（monocistron）。基因结构具体有三种不同的情况： 1、几个tRNA分子串连在一起串联的； 串联的tRNA分子都是相同的； 串联的tRN
5、A分子是不同的； 2、由tRNA和rRNA串联组成； 3、tRNA前体为单顺反子,原核生物中三种tRNA前体分子,（二）原核生物tRNA前体的加工,tRNA的加工分成3个阶段：,（1）“斩头”，形成5末端。 RNaseP是由蛋白和RNA组成的复合体，分子量为130kDa，其RNA长375nt。RNaseP具有内切酶的活性，可切除前体tRNA 5端的前导序列，此酶不识别特殊的序列，而识别二级结构发夹所组成的tRNA。,（2）“去尾”，形成3-OH末端。 此过程由内切酶RNaseF和外切酶的共同参与。前者识别发夹结构，后者识别CCA序列。对于具有CCA末端的1型tRNA前体修整3端的外切酶是RNa
6、seD，在CCA末端它一次切除（或逐步切除）3的碱基。对于没有CCA序列的2型tRNA前体分子来说，还不清楚是通过何种RNase外切酶来切。但是，当前体切除3端附加序列后，必须外加CCA。,“斩头”,“去尾”,（3）修饰：在前体tRNA的一些专一部位的碱基需要通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等的作用进行修饰成为特殊的碱基，如氨基酸臂上5的4-硫尿苷（4tu），D臂上的2甲基鸟苷（2mG），TC臂上的假尿苷（）以及反密码子环上的2异戊腺苷（2ipA）,二、rRNA 前体的加工,（一）真核生物rRNA基因结构,真核生物的18S、5.8S和28S rRNA基因串联在一起形成一个转录本，彼此被间
7、隔区分开;,不同生物的 rRNA 前体大小不同： 哺乳动物为45S；果蝇38S；酵母37S；四膜虫35S,每个重复单位之间的间隔DNA序列不转录，称为非转录间隔序列。,在转录时或转录后，甲基化酶立即结合到转录本上。,真核生物5S rRNA基因也是成簇排列的，中间隔以不被转录的区域。由RNApol 转录，转录后只需要进行简单的加工，或者根本不需要进行加工。,高等真核生物核基因组前体rRNA中一般没有内含子。,18S RNA 结合39个甲基化酶,28S RNA 结合74个甲基化酶,推测：甲基化用于标明转录本的加工区域;,（二）rRNA前体的加工过程, 切除5端的前导序列，45S初始转录本变成41S
8、中间产物；,从41S的中间产物中先切下18S的片段，产物分别为20S（含18S rRNA片段）和32S；,32S中间产物（含5.8S和28S rRNA）中的5.8S和28S之间进行部分退火，形成发夹结构；,通过外切酶等将20S中残余的ITS切除；将已退火的32S中的ITS切除掉。,已知整个加工过程是在核糖体上进行的，而不是以游离的rRNA进行加工的。,补充：原核生物rRNA 前体的加工,（一）原核生物rRNA基因结构,rRNA序列是保守的,每个转录单位都含有16S、23S、5S RNA，有时会有一个或几个tRNA。但tRNA的数量，种类及位置都不固定，或在16S RNA和23rRNA之间的间隔
9、序列中，或在3端5S rRNA之后。 16S、23S、5S RNA仅存在于核糖体中且是等比例的。每个转录单位中它们也是等比例的，因此串联转录单位保障了它们的等量关系。,16S,23S,5S,（二）原核生物rRNA前体的加工,rRNA前体的加工主要是由内切酶RNase 负责。首先，P16S和P23S各自的5和3都能互补（茎环），RNase 在茎上交错切割产生了P16S，P23S和P5S rRNA前体；然后，由外切酶进行修正，切除多余的部分，形成成熟的rRNA分子。,三、mRNA 前体的加工,1、 5端形成 帽子结构（m7GpppNp ） 2、3端加上多聚腺苷酸尾巴（poly A tail） 3、
10、中部剪接除去内含子 4、链内部核苷酸的甲基化,hnRNA转变成mRNA的加工过程包括：,（一）5-端加上帽子结构（mGpppNp）,1、 帽子的种类,帽子0（Cap-0） m7GpppXpYp m7G 7-甲基鸟苷三磷酸 帽子1 （Cap-1） m7GpppXmpYp 第一个核苷酸的 2-O 位上产生甲基化 （A N6 位甲基化） 帽子2（Cap-2） m7GpppXmpYmp 第二个核苷酸的 2-O 位上产生甲基化 （A、G、C、U）,单细胞真核生物只有 Cap-0,Cap-1 是其余真核生物的主要帽子形式,Cap-2 存在于某些真核生物中,2、 帽子结构的生物学功能, 使mRNA免受核酸酶
11、的降解，增加mRNA的稳定性； 有助于mRNA越过核膜，进入细胞质； 被蛋白质起始因子识别，使mRNA能与核糖体小亚基结合并开始合成蛋白质。,（二）3-端加上多聚腺苷酸尾巴（polyA）,几乎所有真核生物成熟的mRNA末端都有一串约250个腺嘌呤核苷酸尾巴。它们并非模板DNA编码，而是在转录完成时由poly (A) 多聚酶合成。加尾位置不在转录物的最末端，而是在接近末端的内部位点。在切除mRNA 3末端的一段序列后，再加上多聚腺苷酸。,加尾是在核内完成，先于mRNA中段的剪接，和转录终止同时进行。,新合成的mRNA的3-端含两个明显的加尾信号。第一个加尾信号位于poly (A)上游，一致顺序为
12、5AAUAAA3；第二个加尾信号位于5AAUAAA3顺序下游约15-24 nt位置处，有一段富GU序列，紧随其后通常有一串富U的顺序。,5-AAUAAA-1524 bp-GUGUGUUGGAAUUUUUUGUGU-3,如果改变5AAUAAA3位置，加尾位点改变；缺失，则不发生加尾。,富GU序列和紧随其后的富U序列对正常的加尾不可缺一。,1、 ploy（A）加尾信号,2、poly（A）的生物学功能, 提高mRNA在细胞质中的稳定性。 协助mRNA从细胞核向细胞质转运。 作为核糖体的识别信号，使mRNA分子有效翻译。 对基因的表达调控有重要作用。,（三）mRNA的内部甲基化,真核生物mRNA分子中
13、有许多甲基化的碱基； 具体的甲基化位点还不太清楚； 主要是：N6-甲基腺嘌呤（m6A）； 推测可能为mRNA的剪切提供信号。,（四）核mRNA前体的剪接（Splicing）,真核不连续基因的初级转录产物中，外显子与内含子交替出现-割裂基因（Split gene）；,转录后把内含子切除而把外显子连接起来产生成熟RNA分子的过程，叫RNA剪接（RNA splicing）。,内含子在真核基因中所占的比例很高，甚至超过99%。,1、核mRNA内含子剪接位点特征,内含子总是由GU开始，以AG结束，其规律称为GU-AG法则（GU-AG rule) 或Chambon法则。,5端剪接位点(供位)相邻的保守序列
14、：5-AGGUPuAGU-3,3端剪接位点(纳位)相邻的保守序列：5-(Py)nNCAG-3,分枝点保守序列：Py80NPy87Pu75APy95，其中A为百分之百保守，且具有2-OH。,mRNA前体正确剪接所必需的,2、参与核hnRNA剪接的主要物质,snRNA (small nuclear RNAs，核内小分子RNA）,snRNP,SnRNA一般300碱基，包括U1-U6等；,在自然状态下， snRNAs与相关的蛋白质形成复合 物-SnRNP,在剪接过程中有5种snRNAs 参加，它们是U1、U2、 U4、U5、和U6；,snRNP、hnRNA、其他相关蛋白质和剪接因子（Splicing
15、Factor SF），形成呈椭球体的复合物-剪接体（Spliceosome）；,hnRNA剪接通过剪接体完成,各种SnRNA功能表,U1 snRNA自我配对形成了多个茎环结构，从而构成了不同的功能区。Sm结合位点是和其他snRNP相互作用的区域。 其5端有一保守序列：3-CAUUCAU-5。 这一序列可与内含子5端的边界序列互补结合。,U2与分枝点配对,U6与mRNA 5端配对,U6 snRNA既能与U4配对也能与U2配对,3、剪接机制（简化）,第一次转酯左外显子、内含子剪切套索 第二次转酯外显子连接、套索状内含子释放 剪接体解体与套索降解同步,4、具体的剪接机制,U1与U2作用使内含子的 5
16、端和 3端带到一起,U1通过与 5剪接点互补而结合,U2识别并结合分支点A,U1、U2、mRNA与 U4U5U6复合物形成一个完整的剪接体,U1、U4脱离，形成活性剪接体，通过两次转酯反应完成内含子剪切,U1通过与 5剪接点互补而结合,U2AF与 3剪接点内含子结合,U2识别并结合分支点A ，并在SF1和BBP帮助下使内含子的 5端和 3端带到一起,U4/U5/U6复合物与U1/U2结合,4、具体的剪接机制,U1脱离,U4脱离，U6与U2间发生第一次转酯反应，套索结构形成,第二次转酯反应，U2/U5/U6与套索结构结合,成熟的mRNA释放,续上页,四、其他的内含子剪接方式,1、内含子的分类,根
17、据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为四类。,I类：线粒体、叶绿体及低等真核生物细胞核的rRNA基因；,II类：线粒体、叶绿体的mRNA基因；,III类：大多数真核生物核mRNA的基因；,tRNA内含子： tRNA基因。,2、剪接方式,方式一：由剪接装置完成（核mRNA内含子） 可供识别的特异序列（GU-AG） 剪接装置由多种蛋白质和核蛋白组成-剪接体； 方式二：自我剪接（两类内含子 、 ） 形成特定的二级结构， 具有催化剪接能力的RNA ； 方式三：需要蛋白质酶参与的剪接（酵母tRNA） 前两种剪接都属于转酯反应,3、核酶（ Ribozyme ）,核酶发现的历史：,In 1967, Ca
18、rl Woese, Francis Crick, and Leslie Orgel were the first to suggest that RNA could act as a catalyst based upon findings that it can form complex secondary structures.,The first ribozyme was discovered in the 1982 by Thomas R. Cech and his coworkers who were studying RNA splicing in Tetrahymena ther
19、mophila.,在四膜虫（Tetrahymena thermophila）中，26S rRNA分子含有1个0.4 Kb的内含子。,17S,5.8S,26S,ETS1,ITS1,ITS2,ETS2,17S,5.8S,26S,IVS,1982年，Thomas Cech及其同事发现，一个仅含有纯化的6.4 Kb前体、ATP及GTP而没有酶蛋白的对照实验样品中发生了剪接作用。进一步实验证实，在核苷酸存在的条件下，RNA发生了自我剪接（self-splicing）。实验结果表明：RNA分子也具有高度特异的催化活性。,Kelly Kruger, Paula J. Grabowski, Arthur J.
20、 Zaug, Julie Sands, Daniel Gottschling and Thomas R. Cech. 1982. Self-splicing RNA: autoexcision and autocylcization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena. Cell 31:147-157,核酶的分类,根据催化反应的类型，可分为2大类：,剪切型核酶,剪接型核酶,3种剪切型核酶的二级结构,Elizabeth A. Doherty and Jennifer A. Doudna. RIBOZYME STRUCT
21、URES AND MECHANISMS. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.,2001,30:45775.,锤头型,发夹型,HDV,4、I类含子的剪接,结构特点：,（1）5剪接点和3剪接点-U G ,（2）有由保守序列形成的二级结构,a、保守序列为 5PQRS3,P与Q互补、R与S互补而形成中部核心结构,b、 二级结构中还包括内含子与外显子的某一序列 互补所形成的二级结构。,内部引导序列（interal guide sequence，IGS）。,I类含子的二级结构,四膜虫rRNA内含子的二级结构,5-端核苷酸序列,I类内含子的自我剪接过程,3、II类含子的剪
22、接,结构特点：,（1）剪接点序列为5GUGCG- - -YnAG，符合GU-AG法则,（2）分枝点保守序列： -Py Pu Py Py U A Py- 。其中A为百分之百保守，且具有2-OH。,（3）二级结构,形成6个茎环结构，使两个并列的功能区靠近。,形成6个茎环结构，使两个并列的功能区靠近。功能区5和功能区6被两个碱基隔开。功能区6含有1个不配对A残基，其上带有2-OH，发动第一次转酯反应。,类内含子的二级结构,II类内含子的自我剪接过程,与前所叙的核基因mRNA的剪接过程相比，和类内含子剪接的最大特点是不需要其他成分的参与，RNA分子本身能形成剪接所需的空间结构和催化活性区域。在核基因m
23、RNA的剪接过程中，需要多种成分特别是snRNA与RNA前体共同作用才能形成剪接所需的空间结构，产生具催化功能的区域。,几种不同内含子剪接反应的区别,五、 RNA的编辑和再编码,指转录后的RNA在编码区发生碱基的替换、插入或丢失等现象。,（一）RNA的编辑（RNA editing）,碱基的替换-哺乳动物载脂蛋白基因转录产物的编辑,指导RNA指导的编辑-利什曼原虫属细胞色素b mRNA的编辑,例子：,尿苷酸的缺失和添加-锥虫线粒体mRNA转录后编辑,概念：,1、碱基的替换,表明：RNA编辑可能是充分发挥生理功能所必须的。,2、尿苷酸的缺失和添加,1986年，R. Benne在研究锥虫线粒体mRN
24、A转录加工时发现mRNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸；1990年在高等动物和病毒中也发现了编辑现象。,3、指导RNA指导的编辑,研究发现，利什曼原虫属细胞色素b mRNA中含有许多独立于核基因的尿嘧啶残基。,指导RNA与被编辑区及其周围部分核酸序列虽然有相当程度的互补性，但该RNA上存在一些未能配对的腺嘌呤，形成缺口，为插入尿嘧啶提供了模板。,特异性插入这些残基的信息来自指导RNA（guide RNA）。,反应完成后，指导RNA从mRNA上解离下来，而mRNA则被用做翻译的模板。,指导RNA指导的编辑机制,4、RNA编辑的生物学意义,校正作用：有些基因丢失的遗传信息可以通过RNA编辑得到恢
25、复；,调控翻译：通过编辑可以构建或去除起始密码子和终止密码子，是基因表达调控的一种手段；,扩充遗传信息：能使基因产物获得新的结构 和功能，有利于生物进化。,（p101）,（二）RNA的再编码（RNA recoding）,概念：,mRNA在某些情况下不是以固定的方式翻译，而可以改变原来的编码信息，以不同的方式进行编码，科学上把RNA编码和读码方式的改变称为RNA的再编码。,例子：,核糖体程序性+1/-1移位：mRNA读码信号发上+1/-1移位；,核糖体跳跃：核糖体跳过多个核苷酸；,终止子通读：硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸,意义：,可使一种mRNA产生两种或多种相互关联但又不同的蛋白质，可能是蛋白质合成的一种调节机制。,第五节 原、真核生物mRNA的特征比较,原、真核生物mRNA转录后加工,原、真核生物mRNA结构特征比较,1、原核生物mRNA的特征,半衰期短,多以多顺反子的形式存在,5端无“帽子”结构,2、真核生物mRNA的特征,5端存在“帽子”结构,3 端没有或只有较短的poly（A ）尾巴,多数mRNA 3端具有poly（A ）尾巴,以单顺反子的形式存在,第六节 RNA合成与DNA合成异同点,相同点：,1、都以DNA链作为模板 2、合成的方向均为53 3、聚合反应均是通过核苷酸之间形成的3,5 -磷酸二酯键，使核苷酸链延长。,不同点：,本章结束 谢谢！,