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1、第2章 纯培养和显微技术,微生物的基本特点：,小！,在绝大多数情况下都是利用微生物的群体来研究其属性；,微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存；,培养技术在微生物学中具有重要意义！,参见P13,在研究中所使用的微生物培养群体：,培养物：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体,混合培养物：含有多种微生物的培养物； 纯培养物： 只有一种微生物的培养物；,通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果,纯培养技术是进行微生物学研究的基础！,参见P13,微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观
2、察和研究。 （P12第一段）,微生物的基本特点：,小！,参见P13,第一节 微生物的分离和纯培养,无菌概念、纯培养概念、纯培养物的获得方法,第二节 显微镜和显微技术,各种显微镜的基本原理及其样品制备方法,第一节 微生物的分离和纯培养,从混杂的群体中分离特定的某一种微生物， 是研究和利用微生物的第一步。,一、无菌技术,用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物； 在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身也不污染环境； （P14第1段）,（参见P13、14）,一、无菌技术,参见P14,一、无菌技术,参见P14,1、微生物培养的常用器具及其灭菌,常用的器具：,试管、瓶子、培养皿等,1887
3、年，R J Petri 发明,Petri dish,参见P14,装有培养基后称为“培养平板” Or “平板”(plate),(具体灭菌方法第6章介绍),高温干热灭菌,高压蒸汽灭菌,试管、瓶子、培养皿等,常用的灭菌方法：,1、微生物培养的常用器具及其灭菌,常用的器具：,参见P14,2、接种操作,无菌操作：,火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行,参见P15,二、用固体培养基分离纯培养,培养基：,液体培养基； 固体培养基； 半固体培养基；,参见P15,二、用固体培养基分离纯培养,培养基：,液体培养基； 固体培养基； 半固体培养基；,固化剂,柯赫（Robert Koch） 的助手W Heese和 他的夫人F
4、ran Heese,参见P15,琼脂,二、用固体培养基分离纯培养,菌落（colony）：,单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、 有一定形态结构的子细胞生长群体。 （P15，倒数第2段）,众多菌落连成一片,菌苔（lawn）,不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征 （形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据 （见P15，倒数第二段；图2-3）。,斜面培养基上细菌菌苔特征,液体培养基中细菌生长特征,二、用固体培养基分离纯培养,使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：,稀释！,参见P1
5、6,二、用固体培养基分离纯培养,1、稀释倒平板法,2、涂布平板法,操作较麻烦，对 好氧菌、热敏感 菌效果不好！,使用较多的常规 方法，但有时涂 布不均匀！,参见P16,二、用固体培养基分离纯培养,3、平板划线法,参见P16,二、用固体培养基分离纯培养,3、平板划线法,参见P16,3、平板划线法,参见P16,二、用固体培养基分离纯培养,4、厌氧微生物的分离,厌氧罐,厌氧手套箱,参见P17,二、用固体培养基分离纯培养,4、厌氧微生物的分离,厌氧罐,厌氧手套箱,参见P17,二、用固体培养基分离纯培养,4、厌氧微生物的分离,稀释摇管法,参见P16,三、用液体培养基分离纯培养,稀释法进行液体分离必须在同
6、一个稀释度的许多 平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。,在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为97.5%,参见P17,四、单细胞（孢子）分离,一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；,操作难度与细胞或个体的大小成反比；,参见P1718,通过机械、空气或油压传动装置来减小手的动作幅度， 在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个 微生物细胞或孢子以获得纯培养。,利用刚才介绍的技术，我们是否有可能获得某一个生态环境（例如1克土壤）中所有种类细菌的纯培养？,假设待分离的细菌均能利用某一相同的培养基生长,同一生态环境中混杂存在着不同种类的细菌； 不同细菌在数量存在差异；,微生物在自然条件
7、下存在的特点：,五、选择培养分离,抑制大多数其它微生物的生长；,使待分离的微生物生长更快；,使待分离的微生物在群落中的数量上升， 方便用稀释法对其进行纯化。,微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：,没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切微生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。 （ P18 第2大段）,使待分离的微生物生长“突出”；,直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。,参见P18,五、选择培养分离,1. 利用选择培养法进行直接分离,待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制,高温下培养：分离嗜热细菌；,培养基中不含N：分离固氮菌；,培养基加抗生素：分离抗性菌；
8、,参见P18,五、选择培养分离,1. 利用选择平板进行直接分离,待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物,牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；,参见P18,五、选择培养分离,2. 富集培养,从自然界中分离到所需的特定微生物,特定的环境条件,仅适应于该条件的微生物旺盛生长,待分离微生物在群落中的数量大大增加,参见P18,2. 富集培养,富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。 （ P 19，第二段）,根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类；,分离培养在特定环境中能生长的微生物；,参见P18,七、微生物的保
9、藏技术,（移到第八章 微生物遗传）,微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。 （P12第一段）,微生物的基本特点：,小！,参见P13,第二节 显微镜和显微技术,几个基本概念：,放大 分辨率 反差,被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！,特定条件下能辨析的两点之间的最小距离,被观察物区别于背景的程度,被观察物区别于背景的程度,与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。 P21 倒数第一段,参见 P 21,100%,200
10、%,800%,一、显微镜的种类及原理,1. 普通光学显微镜,复 式 显 微 镜,一、显微镜的种类及原理,1. 普通光学显微镜,光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？,如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？,目镜：10 15 ；物镜： 100 ；总放大倍数10001500 ；,使用油镜，即在100物镜和载玻片之间滴加香柏油；,参见P 22,0.5 l 最小可分辨距离(分辨率）= n sin q,1. 普通光学显微镜,分辨率与所用波长成反比！,参见P 22,1. 普通光学显微镜,0.5 l 分辨率（最小可分辨距离）= n sin q,q为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和
11、工作距离,低倍镜的分辨率低于高倍镜,参见P 22,1. 普通光学显微镜,0.5 l 分辨率（最小可分辨距离）= n sin q,N：玻片与物镜间介质的折射率,显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质,空气（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）,参见P 22,用浸没油取代空气的作用：,介质折射率提高,分辨率得到提高,参见P 22 第2大段,光线在穿过折射率不同的介质时发生折射,改变光折射角度,增加照明亮度,很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。（ P22 第2大段）,浸没油与玻璃的折射率相近,光学显微镜物镜的特性,人
12、眼的分辨能力在0.2 mm左右，因此光学显微镜的最大 有效放大倍数（使用油镜）是1,000到1,500。,参见P 22,一、显微镜的种类及原理,2. 暗视野显微镜,普通光学显微镜又称明视野显微镜 其照明光线直接进入视野，属透射照明。 （参见P 23 第1大段）,一、显微镜的种类及原理,2. 暗视野显微镜,参见P 23 第1大段,一、显微镜的种类及原理,3. 相差显微镜,相差显微镜用特殊的聚光器和物镜来强化生物不同结构的折射率差异。光通过具有不同折射率的物体会减速并发生衍射不同介质中的差异会导致亮度的不同。 参见P 23 第2大段,许多染料会杀死微生物，因此大多数微生物活体无法进行染色观察。,一
13、、显微镜的种类及原理,5. 透射电子显微镜；6. 扫描电子显微镜,分辨率与所用 波长成反比！,参见P 24,电子束通过电磁场时会产生复杂的螺旋式运动，但最终的结果是正如光线通过玻璃透镜时一样，产生偏转、汇聚或发散，并同样可以聚集成像。而一束电子具有波长很短的电磁波的性质，其波长与运动速度成反比，速度越快，波长越短。在理论上，电子波的波长最短可达到0.005 nm，所以电子显微镜的分辨能力要远高于光学显微镜。 （P24第2大段）,一、显微镜的种类及原理,5. 透射电子显微镜；6. 扫描电子显微镜,参见P25,一、显微镜的种类及原理,5. 透射电子显微镜；6. 扫描电子显微镜,参见P25,二、显微观察样品的制备,略！,第二章思考题,1、为什么无菌技术和纯培养技术是微生物学建立与发展的 基石？ 2、试分析比较各种获得微生物纯培养方法的特点 3、试利用表格形式对各类显微镜在原理、样品制备和观察 方面的异、同进行概括、比较。 4、你认为样品制备和显微观察中（光镜和电镜）应通过哪 些方法改变样品的反差以改善观察效果？ 5、 试找到一篇使用微生物照片的科学文献（科研论文）， 分析该文为什么要使用微生物照片，采用的是何种显微 观察技术？依你之见，该文作者的这张照片还可以用哪 些技术获得？,