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1、细胞周期及其调控,前言,细胞周期及其调控的重要性 细胞周期及其调控的复杂性,细胞周期,细胞周期调控,细胞周期与医学,通过三部分的学习了解细胞周期,细胞周期,基本概念,1.细胞周期同步化,1.1 代谢抑制法,原理：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成，而不影响其他时期细胞的运转，最终可将细胞群阻断在S期或G/S交界处。 优点：同步化程度高，适用于任何培养体系。可将几乎所有的细胞同步化。 缺点：容易产生非均衡生长，个别细胞体积增大。,1.2 细胞分裂收获法,方法：使单层培养的细胞处于对数增殖期，此时分裂活跃，有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性低，此时轻轻振荡，M期细胞脱离器壁，悬浮于培
2、养液中，收集培养液，再加入新鲜培养液，依法继续收集，则可获得一定数量的中期细胞。 优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。 缺点：获得的细胞数量较少。（分裂细胞约占1%2%）,2.1 有关名词,TG1：G1期的持续时间 TG2：G2期的持续时间 TS： S期的持续时间 TM： M期的持续时间 TC： 一个细胞周期的持续时间 PLM：标记的有丝分裂细胞所占的比例 TDR：胸腺嘧啶核苷（Thymine Deoxyriboside, TDR ），是DNA的特异前体，能被S期细胞摄入，而掺进DNA中。通常使用的是3H或者14C标记的TDR。,2.细胞周期时间的测定,细胞周期时间的长短因细胞的类
3、型、状态和环境而异。 标记有丝分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM）是一种常用的测定细胞周期时间的方法。 其原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。,2.1 有关名词,TG1：G1期的持续时间 TG2：G2期的持续时间 TS：S期的持续时间 TM：M期的持续时间 TC：一个细胞周期的持续时间 PLM：标记的有丝分裂细胞所占的比例 TDR：胸腺嘧啶核苷，是DNA的特异前体，能被S期细胞摄入，而掺进DNA中。通常使用的是3H或者14C标记的TDR。,2.2 PLM法原理,待测细
4、胞经3H-TDR标记后，所有S期细胞均被标记。 S期细胞经G2期才进入M期，所以一段时间内PLM=0。 开始出现标记M期细胞时，表示处于S期最后阶段的细胞，已渡过G2期，所以从PLM=0到出现PLM的时间间隔为TG2。,S期细胞逐渐进入M期，PLM上升，到达最高点的时候说明来自处于S最后阶段的细胞，已完成M并进入G1期。所以从开始出现标记的M期细胞到PLM达到最高点（100%）的时间间隔就是TM。 当PLM开始下降时，表明处于S期最初阶段的细胞也已进入M期，所以出现LM到PLM又开始下降的一段时间等于TS。,从LM出现到下一次LM出现的时间间隔就等于TC，根据TC=TG1+TS+TG2+TM即
5、可求出的TG1长度 事实上由于一个细胞群体中TC和各时相不尽相同，第一个峰常达不到100%，以后的峰会发生衰减，PLM不一定会下降到零，所以实际测量时，常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM。,细胞周期 各时相的动态,1. G1期动态,早G1期：细胞生长 R点：分裂决定 晚G1期：复制准备,细胞周期时间的长短主要由G1期决定,2.S期动态,DNA合成 染色质组装 中心粒复制,3.G2期动态,复制检查 分裂准备,G1-G2期主要物质的合成,4.M期动态,染色体分离 胞质分裂,细胞周期调控,细胞周期驱动力,1.引擎：cyclin-CDK系统,1.1 Cyclin-Cdk的类型,1.2 C
6、ylin-CDK的激活,Cdk activating kinase(CAK),Cdk7和CyclinH 一起形成CAK; 催化cdk2和cdk4分子第161位苏氨酸的磷酸化，从而激活这些蛋白激酶的活性。,1.3 Cdk/Cyc在细胞周期中的调控作用,A. G1期,B. S期和G2期,C. M期,Cdc25,近来的研究资料表明,3种Cdc25 亚型在G1/ S、G2/ M 转变和M 期中都有作用。3 种亚型能协同启动细胞进入S 期和调控G2/ M 的转变。 Cdc25A 对于有效地促进细胞进入S 期是必需的, Cdc25A 表达量的增加可促进G1/ S和G2/ M 检验点之间的转变。 Cdc25
7、B和Cdc25C 在控制进入M 期和G2/ M 检验点具有重要的作用。然而,Cdc25B 在G2/ M 检验点早期阶段似乎具有更突出的作用,而Cdc25C控制G2/ M 检验点的后期阶段。,Cdc25 的作用机制,Cdk 激酶活性通过Thr-14 和Tyr-15 (在Cdk1中) 的磷酸化作用而被负调控。 Cdk1 的抑制性激酶在高等真核细胞中是wee1 和myt1 蛋白激酶。 这些激酶通过Cdc25 磷酸酶的催化作用而发生去磷酸化,导致Cdk1/ cyclin B 发生活化作用。,2.原动力：周期性基因表达,3.清道夫：泛素化蛋白质降解系统,泛素介导的细胞周期调控蛋白的降解,泛素被称为蛋白质
8、降解标签，结合了泛素的蛋白质能被26S蛋白酶体识别并分解成短肽； 这是短命蛋白质和一些异常蛋白质降解的普遍途径。,a.蛋白质的泛素化修饰过程,泛素先被合成为一种没有活性的前体，之后在C端水解酶的作用下暴露双Gly位点而进行成熟化。 此后泛素依次被泛素激活酶E1活化，转移至结合酶E2的半胱氨酸残基上，被连接酶E3连接到靶蛋白表面的赖氨酸残基上。,b.蛋白质的泛素化修饰作用,4.外动力：生长因子信号系统,生长因子是一大类与细胞增殖有关的信号物质，目前发现的生长因子多达几十种，多数有促进细胞增殖的功能。 生长因子不由特定腺体产生，主要通过旁分泌作用于邻近细胞。 细胞在生长因子的刺激下，G1期cycl
9、in D表达 。,表皮生长因子 转化生长因子/ 骨形成蛋白 神经生长因子 成纤维细胞生长因子 粒细胞集落刺激因子 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 血小板衍生生长因子 红细胞生成素 血小板生成素 肝细胞生长子 .,生长因子的分类,细胞周期检控点,简介,检控点是检查和控制细胞周期进程的信号通路。主要是检查和控制细胞周期中的一些关键转换。 在细胞周期程序出现问题或者环境条件变化时被激活，通过增强对Cdk的结合抑制和磷酸化来阻滞细胞周期进程，同时启动DNA修复、细胞凋亡等应对机制。,1.Cdk抑制因子（CKI）,2.细胞周期检控点,细胞周期检控点的作用,主要是调节细胞周期的时序转换，以确保DNA复制、染
10、色体分离等细胞重要生命活动的高度精确性，并对DNA损伤、DNA复制受阻、纺锤体装配和染色体分离异常等细胞损伤及时做出反应，阻滞细胞周期的运行，诱导相关基因表达，使细胞有充分的时间对损伤进行修复，以防止突变和遗传不稳定的发生。 如细胞损伤过大而无法修复，检控系统则启动相应的细胞凋亡机制将损伤细胞加以清除，以确保细胞基因组的完整性和遗传的稳定性。,2.1 G1/S: DNA损伤检控点,DNA损伤,ATM/ATR,细胞周期检测点激酶1/2,Cdc25,激活,激活,磷酸化,出核降解，不能解除细胞核内 Cdk2的磷酸化抑制，防止细胞进入S期,Mdm2,磷酸化,不能结合p53，p53留在细胞核内被磷酸化,
11、P21表达,抑制cdk2/4/6活性，使细胞停滞在G1期,非p53依赖途径,P53依赖途径,DNA损伤检控的两个途径,P53: gene regulatory protein. DNA damage activates p53 by an indirect mechanism. Mdm2 acts as a ubiquitin ligase that targets p53 for destruction by proteasomes. Phosphrylated p53 reduce its binding to Mdm2. P21(CKI protein) binds to G1/S-Cd
12、k and S-Cdk and inhibits their activities, thereby helping to block entry into S phase.,2.2 G2/M: DNA复制检控点,DNA差错信号,ATM/ATR,细胞周期检测点激酶1/2,Cdc25,激活,激活,磷酸化,出核降解，防止Cdk1磷酸化抑制的解除,Waf1/Cip1,磷酸化激活,Cdk1磷酸化抑制,2.3中期/后期：分裂检控点,An overview of the cell-cycle control system,Appendix: 细胞周期调控蛋白,细胞周期与医学,1.周期蛋白表达异常,Cycl
13、in D over-expressed or amplified in a variety of human cancers. Breast 50% Head & Neck 43%* Esophageal 30% Bladder 15% Liver 10% S.C. Lung 10% *over-expression at time of surgery associated with increased risk of recurrence,2.周期蛋白降解异常,Over-expression of Cyclin A or Cyclin E may result from failure t
14、o undergo ubiquitin-mediated degradation.,Insertional Mutagenesis of Cyclin A in Liver Cancer,Curr. Opin. Genet. Dev. 3:11, 1993,Consequence: Protein is not degraded Cyclin A over-expressed,3.磷酸酶过表达,cdc25A, cdc25B mRNA and protein over-expressed in: Aggressive Lymphomas (40-100%) Head and Neck tumor
15、s No over-expression in indolent lymphomas. cdc25C levels relatively low in all cancers.,Deactivation of CDK activity by phosphorylation of ATP binding site or reactivation by phosphatases.,Cancer Res. 57:2366, 1997 Int. J. Cancer 89: 148, 2000,4.CAK活性异常,Cdk7 moderately elevated in a variety of huma
16、n tumor cell lines and biopsy specimens. Retinoblastoma Fibrosarcoma Osteosarcoma Cervix Soft Tissue Sarcoma,Int. J. Cancer 66: 732, 1996,5.CKI缺失,p16 Deletion (9p21),Most common deletion in Glioblastoma (GBM) More common in primary than secondary GBM Associated with EGFR amplification Not associated
17、 with p53 mutation Confers significantly higher rates of proliferation, and poor prognosis,Science 264:436, 1994,p27-/-,Increased animal size and organ overgrowth(particularly spleen and thymus ) Female infertility, Disorganization of retina Pituitary hyperplasia (adenoma) No defect in response to TGF-B,p27 Knockout Mouse,Littermates at 12 weeks Thymus Glands,Cell 85:710, 1996,p27 +/+,p27 -/-,6.生长因子及其受体突变,