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1、第 二 章 细胞分离与破碎 Cell isolation and disruption,一、预处理的目的 1 改变发酵液的物理性质，提高固液分离效率 加热 调pH 絮凝和凝聚 2 尽可能使产物转入便于后处理的某一相中 例如:四环素类抗生素的生产,2.1 发酵液的预处理,3 去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作 杂质中影响最大的是高价无机离子和杂蛋白等,二、预处理的具体方法 1. 高价无机离子的去除方法 去除钙离子：通常使用草酸。但由于草酸溶解 度较小，不适合用量较大的场合。,去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。 用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。例如：环丝氨酸的提
2、取。 去除铁离子: 加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。,2 杂蛋白质的除去 (1) 沉淀法 盐析 调节pHpI (2) 吸附法 加入吸附剂或沉淀剂 (3) 变性法 加热，大幅度调节pH，加有机溶剂或表面活性剂等。,(4) 凝聚Coagulation和絮凝flocculation 目前工业上最常用的预处理方法之一。 常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理。,向胶体悬浮液中加入电解质，由于双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集（1mm左右）的现象。 常用的凝聚剂有：Al2(SO4)3.18H2O，AlCl3.6H2O，FeCl3，ZnSO4，MgCO3,凝聚,胶体
3、双电层的构造,絮凝 指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大（10mm）的絮凝团的过程。,根据活性基团在水中解离情况的不同，絮凝剂可分为非离子型、阴离子型和阳离子型三类。 根据其来源的不同，工业上使用的絮凝剂又可分为如下三类： (1)有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物。 (2)无机高分子聚合物。 (3)天然有机高分子絮凝剂。,絮凝剂的分类,絮凝效果与絮凝剂的分子量和类型、加量，溶液的pH，搅拌速度和时间等因素有关。,带负电荷的菌体 或蛋白质,阳离子型高分子絮凝剂,电解质,非离子型和 阴离子型高分子絮凝剂,+,包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。,3. 有色物质
4、的去除及其他 1）使用吸附剂去除有色物质 离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等 2）用工业酶制剂可净化发酵产物，除去干扰性浑浊物 淀粉酶：不溶性多糖 单糖,3) 使用惰性助滤剂 硅藻土、纸浆、珍珠岩等 4）加入反应剂 环丝氨酸发酵液用CaO和H3PO4处理,一、 发酵液的过滤特性和滤饼的重量比阻rB 发酵液：高粘度，非牛顿流体， 滤饼可压缩。,2.2 固 液 分 离,滤饼,传统的过滤,cake,Conventional filtration,滤饼的重量比阻rB：表示单位滤饼厚度的阻力系数，是衡量过滤特性的主要指标。 对于不可压缩滤饼，比阻值为常数， 但对于可压缩滤饼，rB=f（p）。,如忽略过滤
5、介质的阻力，恒压下的过滤速率方程式为： q 到瞬间，通过单位过滤面积的滤液量，m3/m2； p 操作压差，Pa； 过滤时间，s； 滤液黏度，Pa.s; rB 滤饼的重量比阻,m/kg; XB 通过单位体积滤液所形成的滤饼干重,kg/m3;,在不同时间测定滤液量,根据过滤面积就可得q 值。以q为横轴， /q为纵轴作图，所得直线获得斜率（M）。,二、影响过滤速度的因素 菌种 真菌易过滤；放线菌过滤较困难，需预处理；细菌过滤十分困难，絮凝预处理。 培养基组成 发酵终止时间,三、固-液分离设备 板框式压滤机 国内广泛采用 优点：结构简单、价格低廉、过滤面积大。 缺点：不能连续操作、劳动强度大、滤液澄清
6、度不高。,2. 鼓式真空过滤机 主要用于霉菌发酵液的过滤 优点： 能连续操作，实现自动化控制，适用于处 理量大而固体含量较多的滤浆。 缺点：压差较小，不适用于滤饼阻力较大的物料。,Dry,Wash,Immersion,Rotation,Knife,Cake,Feed,Rotary vacuum filter,真空旋转过滤机,3. 错流过滤 是一种新的过滤方式，与常规过滤的区别在于它的固体悬浮液流动方向与过滤介质平行 。 优点：过滤速度快 缺点：固液相的分离不太完全,错流过滤模式,进料液,滤出液,回流液,4. 离心分离设备 A 离心分离法 1）差速离心 生化工业最常用的方法 2）区带离心 生化研
7、究 分为差速区带离心和平衡区带离心 用于核酸、蛋白质的分离纯化,B 离心分离设备 1）管式离心机 2）碟片式离心机,3）三相倾斜式离心机 含固量较多的发酵液,细胞破碎:选用物理、化学或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。,2.3 细 胞 破 碎,2.3.1 细胞膜、细胞壁壁的结构和化学组成 1. 细菌 2. 真菌和酵母 由难到易的大致排列顺序为：植物细胞真菌（如酵母菌）革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌动物细胞。,细胞膜的结构,革兰氏阳性菌细胞壁的结构,革兰氏阴性菌细胞壁的结构,2.3.2 细胞的破碎机理 P24 2.3.3 细胞的破碎 一、细胞破碎技术的分类,二、细胞破碎方法 1. 机械破碎 1) 高压匀
8、浆法,其中：S为细胞破碎率；p为操作压力；N为循环操作次数； k为破碎速率常数，与细胞种类和操作温度有关。,特点：适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，不宜用于团状或丝状菌的破碎；由于操作中温度会升高，需对料液作冷却处理，保护目的产物活性。,影响因素：主要有压力、循环操作次数和温度。,2) 珠磨,其中：S为细胞破碎率；t为间歇操作破碎时间；k为破碎速率常数,破碎动力学,其中：t为连续操作破碎时间； V为悬浮液体积,m3; Q为料液流量, m3 /s,影响因素: 破碎效果取决于振动速度、接触时间、助磨剂大小、用量及菌体浓度等。,用于有大量菌丝体和一些有亚细胞器的微生物细胞的破碎。,两种方法的比较,3
9、）撞击破碎,4）超声波破碎 破碎机理: 利用发射5z的超声波 探头处理细胞悬浮液。,可选配变幅杆,可选配变幅杆：2、3，10，15，18 破碎容量：0.5-600ml 占空比:0.1-99.9%,2. 非机械法 1）酶溶法 用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。 外加酶法 微生物细胞：溶菌酶、几丁质酶（真菌） 植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶, 自溶法一种特殊的酶溶方式 微生物产生的溶胞酶水解自身细胞壁上的聚合物结构，使菌体自溶。 用于生产最典型的例子是酵母自溶物的制备。 2）化学法 用化学试剂改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性地渗透出来。 酸碱处理, 化学渗透法 a. 表面活性
10、剂 主要是破坏内膜的磷脂双分子层，释放胞内物质 b. EDTA螯合剂 处理革兰氏阴性菌，对细胞外层膜有破坏作用 c. 有机溶剂 甲苯溶解细胞壁中的类脂 d. 变性剂 盐酸胍,3） 物理法 渗透压冲击法 特点：适用于易于破碎的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌；对革兰氏阳性菌不适用。 冻融法 特点：此法主要适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细胞，特别适用于位于胞间质的酶的释放。,3. 机械破碎法与非机械法的比较,三、破碎率的测定 1. 直接测定法 破碎前用显微镜或电子微粒计数器直接计数完整细胞的量，破碎后用染色法区分。例如革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈紫色，而受损害的呈亮红色。 2. 测定释放的蛋白质含量或酶的活力 与100%的标准数比较 3. 测定导电率 导电率随细胞破碎率的增加而呈线性增加。,四、细胞破碎研究方向 1. 多种破碎方法相结合 2. 与上游过程相结合 上游培养（培养基组成、pH、温度）；用基因工程的方法对菌种改造 3. 与下游过程相结合 在破碎细胞的同时，要考虑碎片对后分离的影响。如碎片太小，固液分 离困难，未除净的碎片将造成层析柱和超滤膜的堵塞。,思考题: 如何预处理发酵液? 凝聚和絮凝的区别 滤饼的重量比阻rB 了解常用固-液分离设备及其特点 常用的细胞破碎方法, 了解机械破碎法所用设备 P33 2、5,