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1、第四节 细菌和链霉菌的分子克隆载体,一、革兰氏阴性菌克隆载体 1. 移动载体（mobilizable vector） 1)特点 i. 广谱宿主范围，即复制子和遗传标记具很宽适应范围 ii. DNA的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于辅助质粒，DNA进入中间宿主细胞可用直接转化 2)结构 i. RK2质粒的结构 a. oriV DNA复制起点 b. DNA复制基因 c. DNA转移基因 d. oriT DNA转移基因 e. 药物抗性基因（Apr Kanr Tcr）,G+菌的质粒和载体,. 移动载体与辅助质粒 pRK2013: 将RK2中的全部转移基因和Kanr基因插入到 E.coli的colE
2、1质粒中构成辅助质粒 pRK290: 余下部分（Apr除外）构成移动载体（约20Kb） * 当选用E.coli为中间宿主时，必须先将pRK290经过直接转化引入E.coli（pRK2013也应转入同一细胞）。当要转移pRK290时，只需将E.coli细胞与其他G细胞混合，在pRK2013的作用下，pRK290可接合转移至终宿主细胞。 3)不相容群（incompatibilitiy group）克隆载体 . P群：RP4 RK2 RP1 R68 2-5拷贝 . Q群：R300B RSF1010 R1162 15-20拷贝 . W群：Sa 2-5拷贝 4）遗传标记基因 大多数为抗生素标记基因，要注
3、意不同G菌中的表达活性,G-细菌中重组质粒的转移,2. 非移动载体(non-mobilizable vector) 1) 特点：不能接合转移，但可经过直接转化进入那些可形成感受态的细菌，具有广谱和窄谱两大类载体 2) 实例： P4D0105-由E.coli噬菌体P4构建而成，适合于E.coli和肺炎克蕾伯氏菌。 . 当辅助噬菌体提供P4整合酶时，该载体可整合到E.coli染色体中，整合入肺炎克蕾伯氏菌染色体则与整合酶无关。 . 该载体含有一个virl突变和在引物酶基因中存在一个琥珀突变(am52)，在无抑制子突变的菌株中，该载体不能自主复制，但在有抑制子突变的菌株中(琥珀抑制子突变体），该载体
4、则可自主复制。,P4D0105载体的结构,二、革兰氏阳性菌（G+）克隆载体 1.枯草杆菌克隆载体 1）B.subtilis作为宿主菌的优点 . 芽孢形成过程可用于阐明细胞发育过程 . 遗传背景较清楚，可直接导入外源DNA . 非致病细菌，因而安全 . 研究结果可用于其它芽孢杆菌 . 存在各种分泌蛋白质 2）B.subtilis作为宿主菌的缺点 . 存在多种蛋白酶基因和相应产物 . 外源DNA导入细胞后不稳定，易发生重组反应,3)克隆载体 .复制子来源 i) 质粒DNA 质粒名称 大小(kb) 标记基因 拷贝数 来 源 pUB 4.5 Kanr 50 金黄色葡萄球菌 pE194 3.7 Eryr
5、 10 同上 pC194 2.9 Cmlr 同上 pSA0501 4.1 Strr 20-50 同上 pBC61 蜡状芽孢杆菌 pLS103 B.subtilis pFTB14 淀粉液状芽孢杆菌 pAB124 Tcr 嗜热脂肪芽孢杆菌 pTB19 25.8 Kanr Tcr 同上 pT181 4.4 Tcr 蜡状芽孢杆菌 pCW7 同上 pAM1 S.faecalis,ii) 噬菌体 105 39.2kb B.subtilis 温和噬菌体 Q11 90kb 同上,当外源DNA插入上述载体时，105生长的功能丧失,当重组DNA分子转入已含有105的溶源化菌株时，重组DNA分子可以十分有效地插入染
6、色体DNA中。这种技术称之为原噬菌体转移技术,ii.标记基因 ) 抗生素抗性基因 ) thy基因(三甲氧苄二氨嘧啶)：该基因表达可导致枯草杆菌死亡，但当外源DNA插入该基因后，宿主细胞便能存活 iii. 表达载体的启动子 常用的有液化芽孢杆菌的-淀粉酶基因启动子和sp2启动子 2. 其它G+ 克隆载体 1) 枯草杆菌的克隆载体常可用于其它芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌 2) 嗜热芽孢杆菌、肺炎双球菌常采用自身的天然质粒所组建的克隆载体,三、链霉菌克隆载体 1. 质粒载体 质粒名称 大小(kb) 来源 宿主范围 拷贝数 SLP1.2 14.5 天兰色链霉菌 窄谱,变青链霉菌 4-5 SCP2(性因子)
7、 1-3 pIJ101 8.9 变青链霉菌 广谱(各种载体构建) 40-300 pFJ103 20 S.granulorubor 生二素,金霉素,弗氏链霉菌 pUC6 9.2 S.cepinosue 广谱 30-40 2. 噬菌体载体 C31-天兰色链霉菌的温和噬菌体，长41 kb，其中32 kb是必须的, 具粘性末端的线状DNA分子，可插入约10 kb外源DNA，可裂解和溶源化生长。,3. 标记基因 杂合致死（lethal zygosis,Ltz)：凡是含有接合质粒的链霉菌可在一受体链霉菌菌丝体上形成麻点，这种转移可导致受体菌生长受到抑制，常用的受体菌是变青链霉菌，这种表型也可用于转化体的选
8、择。,第四节 真菌分子克隆载体,一、酿酒酵母(Saccharomycea cerevisiae)的分子克隆载体 1.克隆载体的种类 1) 按复制方式划分 i.自主复制型； ii. 整合型（非自主复制型） Yeast Integration plasmid(YIp) 2)按复制子来源划分 i. 附加体型- yeast episomal plasmid(YEp)，其复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒-2质粒 ii. 染色体复制型- Yeast Replicating plasmid(YRp)，其复制起点来自染色体上的自主复制序列(ARS-autonomous replicating sequence
9、),酿酒酵母载体的种类和构建,* 若在YRp中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载体YCp-Yeast Centrometric plasmid * 若在YCp 或YRp 中插入一段酵母的端粒结构，该质粒称之为YLp-Yeast Linear plasmid * 若将YLp质粒构建成环状分子,该质粒称之为pYAC载体(Yeast Artificial Chromosome) 3) 标记基因 大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标记，如ARG4，LEU2，TRP1，HIS3和URA3。使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突变），利用
10、遗传互补进行转化体选择的，重组子则是靠在E.coli的转化体中来鉴别的。,2. 酵母克隆载体的结构与特点 1)穿梭载体，YIp除外 2)有适合两种生物的标记基因 3)环状或线状DNA 详见下表,3. YIp载体 该类载体只有依靠本身携带的酵母基因与酵母染色体上的同源DNA整合到染色体上去。这种转化体十分稳定，但也可能发生第二次同源重组(见图)。可用杂交方法证明整合和二次重组结果（如图所示）。,I. 宿主DNA; II和III. 转化子DNA(10道除外); I和II. LEU基因为探针; III. pBR DNA为探针; E1/道1, 4, 7; E2/道2, 5, 8; E1-E2/道3,
11、6, 9和10. 假设上述YIp质粒长6 kb, E1-E2双酶切得2 kb和4 kb两片段; 宿主菌染色体上标记基因用E1酶切得5 kb片段, 用E2酶切得3 kb片段.,YIp载体和杂交示意图,载体的整合和重组,4. YRp载体 1）酵母染色体复制子和ARS的保守性 酵母染色体总长为15,000 kb,根据电镜观察结果预计有400个复制起点，根据基因克隆分离ARS的实验结果估计有480个ARS。 2）YRp的特点 i. 高频转化 ii.转化子不稳定 iii.子代细胞质粒分散不均匀 iv.从酵母转化体中可分离到与转化前相同的质粒DNA v. 可整合到染色体中去，与YIp整合过程相同。,YRp
12、载体和杂交示意图,1-YRp12 探针; 2-URA3探针; 3-ARS探针; 4-pBR322探针 假设宿主菌染色体的ura3基因酶切得3 kb片段, 而ARS片段酶切得1 kb片段.,3）YARp载体（酵母非着丝粒复制质粒） 1.4 kb酵母DNA（EcoRI片段）自我连接而成，该质粒含有ARS1和TRP1基因 该质粒特点: i. 高拷贝,100-200/cell; ii. 比YRp 质粒稳定; iii.可形成核小体; iv. 减数分裂以4+:10分离,YAR质粒的结构,5. YEp载体 1) 酵母2质粒 i. 结构 ii. 结构特点,2质粒的结构,2质粒倒置区的 同向和反向重复片段,2）
13、2质粒载体 YIp中可插入整个或部分2质粒DNA构成YEp。大多数酿酒酵母菌株中都含有2质粒，YEp复制所需的酶可由2质粒提供。 YEp具有YRp载体相同的特点，它还可以与2质粒发生重组。重组质粒不稳定，在无选择压力条件下可很快消失。利用此特点可除去酵母菌株中的天然质粒，即Cir+ Ciro 当YEp进入宿主细胞后，其转化体内所含DNA可得如下杂交图谱（设YEp为8 kb，BamHI有一单切点）,1-YEp13 探针; 2-2质粒探针; 3-LEU2探针; 4-pBR322探针,6. YCp载体 第一个着丝粒于1980年分离自第三染色体, 现已从酿酒酵母菌中分离到多个着丝粒, 它们具有如下保守
14、序列: 足迹分析技术表明,着丝粒中有一个200-250 bp的免受核酸酶作用的DNA序列, 可分为四个区。各着丝粒间不发生交叉杂交。,YCp载体结构,7. YLp载体 真核细胞染色体的末端有两个独特的性质：能使染色体保持稳定，能成功地进行DNA复制。这种末端DNA称之为端粒。端粒结构与染色体其余部分的结构是不同的。人为诱发的染色体断裂很不稳定，如果不能修复，将是致死的。环状质粒经限制酶切后的末端极不稳定，极易发生重组，或发生降解，或发生重新环化。 最先用于构建YLp的端粒来自四膜虫的核糖体DNA，不同长度的YLp具有不同的特点,8. pYAC载体 酵母菌人工染色体(yeast artifici
15、al chromosome, YAC)广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建, 由YLp经适当改造后构建成pYAC载体。 pYAC载体具有以下特点： 1） 双TEL位点； 2） 三个酵母菌遗传标记基因； 3） 一个SUP4基因用于检测重组子，其原理是：SUP4是tRNAtyr的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的ade2赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在SUP4基因中插入外源DNA片段后在转化ade2宿主菌，转化子成红色菌落。,pYAC载体的结构,9. 酵母杂交系统载体 主要用于研究DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质之间的相互作用，可用于新基因的克隆。该类载体可分为两类： 一类载体中存在一
16、个DNA-结合序列(BD)，它与已知的钓饵序列融合；另一类载体则含有基因表达激活序列（AD），它则与未知或已知的捕猎序列融合。 单杂交系统载体 双杂交系统载体 三杂交系统载体 除上述普通型的各类载体外，还有其它不同功能的载体： 表达型yeast expression plasmid; 启动子探针型yeast promoter plasmid, YPp; 杂合型yeast hybrid plasmid, YHp,与阅读框架探针型相同。,双杂交系统和载体,二、丝状真菌克隆载体 1.丝状真菌的特点 1）属低等真核生物，结构简单，易于培养 2）基因结构与高等真核生物的基因结构具较大相似性，如内含子数目
17、、位置等 3）用于生产某些具生物活性的基因产物更具吸引力，如糖基化、蛋白质外泌 4）有些丝状真菌的的遗传背景较为清楚 2. 丝状真菌克隆载体 1） 自主复制载体，其复制起点来源于以下三类DNA： i. 线粒体质粒，如来自间型脉孢菌(N.intermedia)线粒体质粒: pBR322+线粒体质粒+qa-2+ pALS1 转化粗糙脉孢菌 pALS2（高频转化小质粒）,ii. 类质粒（plasmid-like)，如由柄孢壳(Fedospora auseniw)的类质粒(2539bp)所构建的克隆载体可达1000-9000/g的转化率，可重新分离，无重组发生，其复制起点序列与酵母和海拉细胞线粒体质粒
18、复制子序列相同。 iii. 染色体复制子 )构巢曲霉（A.nidulans)复制子 pILJ16(5.4kb)+AMA1(6.1kb) ARp1(4.5kb) 转化频率20,000/106原生质体250ngDNA，可在黑曲霉(A.niger)和米曲霉(A.oryzae)以相同转化频率转化。10-30 copies/单倍体基因组 )玉米黑粉菌(Ustilago maydis)复制子 9104 /ng DNA，25 copies/cell,2）整合型载体 由E.coli克隆载体加上一适合于丝状真菌的标记基因构成，转化频率1-10/g DNA 3）标记基因 amds乙酰胺酶，dir线粒体ATP合成酶，qa-2-分解奎尼酸脱氢酶，acuD异柠檬酸裂解酶，Hgyr潮霉素抗性。,