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1、菌种的保藏和管理,前言,试验过程中，生物样本可能是最敏感的，因 为它们的活性和特性依赖于合适的试验操作和 贮藏条件。实验室菌种的处理和保藏的程序应 标准化，使尽可能减少菌种污染和生长特性的 改变。 按统一操作程序制备的菌株是微生物试验结 果一致性的重要保证。,菌种保藏的重要性,菌种保藏是微生物学检验工作中的一项常规技术，菌种的科学保藏和管理直接关系到检验结果的正确性。,菌种的来源,药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。,广泛收集各种有用的微生物菌种。 选择最适宜的保藏方法。 研究、检验、交换和使用。,菌种保藏的中心
2、任务,国外的菌种保藏机构,常用菌种保藏方法,菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但不至于死亡，以减低菌种的变异率。,标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按验证的方法进行。 标准储备菌株-从国内、外菌种收藏机构获得的标准菌株经复活并在适宜的培养基中生长后,既为标准储备菌株。,常用菌种保藏方法,低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁殖，因此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手段。 标准储备菌株经纯度和特性确认后保存时，可将培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中，并
3、分装于小瓶中,建议采用低温冷冻干燥，液氮储存，超低温冷冻(低于-70)等方法保存。,低于-70或低温冷冻干燥可以延长菌种的保存时间.标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株。 冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再次使用。,工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。,不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶段：,挑选特征典型的纯菌菌落。 确定保藏的合适菌体。 选择最适宜的方法保藏。 定期对保藏的菌种进行检查。,二、菌种的传代和使用,工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代，（从菌种保藏中心获得的标准菌株为第
4、0代）防止过度的传代造成菌种变异。 1代是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。必要时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。,细菌的接种、分离和培养 常用培养基种类 斜面培养基 半固体培养基。 液体培养基 平板培养基,接种方法 涂布法 划线法 穿刺法 直接加入法等,分离：为了获得纯菌种（株），采用的将细菌分离成单个细胞，使其独立分裂繁殖形成单个菌落的操作技术。 分离一般采用平板培养基。 分离方法主要有分段划线法、连续划线法、涂布分离法、倾注分离法等。,培养 ：接种后的培养基，根据不同微生物生长条件的要求，将培养基放在适宜微生物生长的环境中（温度、湿度、
5、氧气等），使其生长繁殖的过程。 需气菌培养法 厌氧培养法,培养后微生物的生长判断 固体培养基 液体培养基,三、菌种的检查与复壮,菌种的衰退 菌种经过长期人工传代培养或保藏，由自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。 控制菌种的衰退方法 控制传代次数 尽量避免不必要的接种和传代，降低突变几率。采用良好的传代保藏方法。中国药典2010年版规定，传代次数不得超过5代。,创造适宜的培养条件 用不同类型的细胞进行传代 采用有效的保藏方法,定期检查 主要检查项目 菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、生化特性及血清学检查。,菌种的复壮 使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性的 过程验室主要采用分离纯
6、化的方法。,四、菌种的管理,1、使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的条件和设备。 菌种应由专人负责管理，管理人员应具有微生物专业知识和技术水平，并应具有较强的责任心。,2、实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度； 包括：每支菌种标注名称、标准号、接种日期、传代次数、进出、收集、贮藏、保存、确认试验以及销毁的记录、标准菌种的申购记录、从标准菌株到工作菌株操作记录，如菌种定期转种传代，鉴定（纯度、特性）、培养基和培养条件、菌种保存的位置和条件及其它需要的程序。,3 、菌种应冷藏或冷冻保存，保存菌种的冰箱不得放置食品和易挥发性药品，放置菌种应有专用的冰箱，应上锁管理。 4、由专人按操作规
7、程和有关要求定期进行传代，并定期对保存的菌种进行检查，一般每年12次，（或定期更换冻干菌种）。发现菌种的异常情况应及时检查。一旦发现菌种污染和变异现象，应立即报告、研究处理。尤其长期保存时。,详细记录 菌种的来源、接收、传代、分离、复壮、使用和鉴定等均应做好详细记录。包括菌保存位置、环境(温度)、种传代或使用时间、名称、菌号、代数、传代或保存形式、分离、复壮方式、使用内容、鉴定情况等都应进行详细的记录。,菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购买应有证明和登记，并包装严密。 菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有详细记录。,菌悬液的制备与保存,菌悬液的制备与保存 参照中国药典2010版培养基适用性试验。,谢谢,