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1、蛋白质的分析,实验目的,了解Western blotting的原理及其意义， 掌握Western blotting的操作方法。 应用Western blotting 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。,实验原理,蛋白质样品经 SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜、PVDF膜）上，以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体和酶标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中培育，显出谱带，即可检测出样品中的特异组分。,操作方法,一电转移 1将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出
2、胶后停止电泳。 2载手套切24张定性滤纸和一张PVDF膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。在膜的一（左）角作一记号（或剪角），依次序浸入100甲醇10秒，去离子水5分钟，然后与滤纸和海绵（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。 3剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号。,“夹心饼”的制作（1）,4. 次序：负极（黑孔板） 纤维垫-12张滤纸-凝胶-PVDF膜-1-2张滤纸-纤维垫-正极板（白孔板）扣上吊扣插进转膜槽中。,“夹心饼”的制作（2）,电转移,按上示意图，接上电源（凝胶一边接负极，PVDF膜一边接正极），恒流电泳2小时，电流为：膜面积(cm2)x2mA。 关闭电源，将膜取出，置塑料盒中用丽春红S
3、染色约5分钟，回收丽春红S，然后用蒸馏水洗去背景染料显色，室温稍干燥后观察蛋白带所在位置，然后用TBST浸泡几次，完全洗去丽春红S染料。,封闭与杂交,6. 将膜放入塑料盒中，加入20mL封闭液，置脱色摇床中缓慢摇动，室温1小时或4（层析冷柜）封闭过夜。 三靶蛋白与第一抗体结合 7弃去封闭液，用TTBS稀释试剂B（1：1000），取510mL加入盒中，室温平缓摇动温育1小时。然后尽量回收抗体溶液，- 20 保存，可重复使用。 用TBST室温洗膜3次，每次10 min15min。,杂交与显色,8. 用TBST稀释试剂C（1：1000），混匀后加入盒中，每张膜约510mL,室温摇1小时； 9. 尽量
4、回收二抗，20C保存； 将膜用TBST洗4次，每次1015min.; 将膜用TBS洗15min., 配制DAB显迹液，将膜放入显色，随时观察带的出现； 蒸馏水洗膜； 绍晾干膜，拍照。 保存膜于密闭的朔料袋中。,试 剂,1. 转移缓冲液：2.9g 甘氨酸（39 mmol/L），5.8g Tris 碱（48mmol/L），0.37g SDS（0.037%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL；每组用量约500mL。 2.封闭液：5% 脱脂奶粉，0.02% 叠氮钠，溶于TBST溶液中；由试剂盒提供（Blocking Solution VW) 3.丽春红S（Ponceaus）染液：0.5
5、g 丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL； 4.TBST洗膜液： TBS 缓冲液含1% Tween-20；高压灭菌后室温保存。,试 剂,5DAB，试剂盒提供,用前用100mM Tris-HCl(pH7.5)配成5mg/mL。 反应液配方(5mL)： 100mM Tris-HCl, pH7.5 2.5mL 5mg/mL DAB 0.5mL 30%H2O2 2.5uL ddH2O 2mL 6TBS: 100mM Tris-HCl, 0.9%(w/v) NaCl, pH7.5，高压灭菌20 分钟，室温保存。 7 SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。,器 材,SDS-PAGE电泳装置一套 电转移膜装置 抗体-酶反应摇床 其它,