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1、蛋白质组学介绍 结合BIO-RAD相关仪器,One Genome Many Proteomes,对生物的生化功能,形成途径与代谢过程之研究而更加了解,Normal gene expression,基因体功能的最终目的就是表现蛋白质;基因表现及调控(Gene expression and regulation)的过程,则是为了保障蛋白质能适时,适地并适量的表现 ,中心法则,蛋白质组学(proteomics)，就是从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域。 蛋白质组学与基因组学的关系：
2、1、蛋白质组与基因组相对应 2、基因组是相对稳定的，而蛋白质组是一个动态的概念 3、蛋白质组是基因组研究不可缺少的后续部分,蛋白质组学,蛋白质组学的研究可以帮助我们去寻找新的疾病指标,相信在不久的将来将有助于监测疾病的进程,更进一步有助于疾病的治疗。 1-1 心血管疾病研究领域 扩大性心肌病变(Dilated cardiomyopathy, DCM )是一种严重的心脏疾病,也是现代繁忙的都市人经常易患的疾病,最后将导致心脏失去功能;病人通常都只能期待换心以维持生命。 运用蛋白质体的方法已经鉴定出心肌中150种蛋白质,比较后发现有25个蛋白质有明显的差异;经由这些已确认的蛋白质资料库与病人(或高
3、危险群)的蛋白质做比对,或许可以在疾病产生初期达到早期预防的目的.,一、疾病诊断,蛋白质组学应用,1-2肿瘤研究领域 1-2-1肺癌 肺癌是最具肿瘤性 (oncological) 的疾病之一.临床上肺癌的诊断往往 已属晚期.直至目前为止,并无有效的治疗方案可得.所以任何有助于肺癌诊断 或预后的发展都是有助于肺癌的治疗方针的。 因此,许多科学家致力于以双向电泳技术研究肺癌.在分析组织病理学上不 同种类的肺癌细胞时,结果发现不同组织病理类型细胞体会有不同的蛋白质表 现图谱。 另外,已发现有一种专一性的蛋白质仅会出现在原发性肺腺癌上.例用此技术将可有效地鉴定出新的肿瘤标志 (tumor marker
4、),在鉴别诊断麟状上皮细胞肺癌与腺癌时有相当大的助益。,蛋白质组学应用,人类的肾脏癌是很难治愈的癌症,其中源自于近端肾小管上皮细胞的肾细胞癌大约占成人恶性肿瘤的3 %.但如同许多实质性肿瘤般,肾细胞癌发现时期均属癌症末期,外科手术已难治愈的阶段.并且无适当的肿瘤标志可参考。 科学家在用双向电泳技术研究肾脏癌组织的研究中发现有四种蛋白质的表现在肾癌细胞中会消失. 虽然该研究没有发现特定的标志蛋白质，但尚有许多可能与该癌症发生相关的蛋白质仍待被鉴定.,1-2-2肾脏癌,蛋白质组学应用,蛋白质组学应用,1-2-3结肠癌 结肠癌是一种常见的癌症.利用双向电泳与免疫转印技术,分析自人类结肠癌细胞粗萃取蛋
5、白质中分离出的一系列蛋白质.并将有意义之蛋白质点切割出,进行蛋白质序列分析以鉴定这些蛋白质。 结果发现 hsp 70 酸性的 isoforms 在结肠息肉 (polypous) 与恶性组织 (malignant tissues) 中的表现不论是在量上或质上均有相当的差异;此外在慢性发炎性肠炎的黏膜或 Crohns 肠炎组织中则有不同的 hsp 70 碱性 isoform 被发现。,蛋白质组学应用,1-3神经精神系统疾病研究领域 对精神分裂症患者以及正常人群的脑脊液进行蛋白质组学的研究。对老年痴呆症(lzhermer 症)的研究：通过对神经原缠结的2DE及质谱分析则发现,其主要蛋白质成份-微管相
6、关蛋白(MAP)在疾病状态下发生了磷酸化、糖基化等多种修饰作用。,二、病原微生物的蛋白质组学研究 1、确定致病菌毒力; 2、寻找新的诊断标记物; 3、为疫苗的研制寻找新的候选抗原; 4、阐明药物抗菌作用机制与病菌耐药性发生机理,为新的抗生 素的研制寻找靶点。,蛋白质组学应用,三、蛋白质组学在药物开发中的应用 疾病特异性蛋白的不断发现为药物设计提供了丰富的靶 点,另外通过翻译后修饰的蛋白质组学研究,使得新药研制获得 了前所未有的契机。以DSPs为靶点,分析其分子结构,定向合 成有效药物成为药物设计的理想模式。,蛋白质组学应用,蛋白质组学研究流程,Condition A,Condition B,S
7、AMPLE PREPARATION,FIRST DIMENSION,SECOND DIMENSION,STAINING,IMAGING,ANALYSIS & EXTRACTION,MASS SPECTROMETRIC IDENTIFICATION OF SPOTS,2-D Expression Proteomics Methodology,根据实验流程介绍相关仪器,样品提取试剂盒,通过多维层析的技术可以获得常规2D技术中比较难得到的低丰度蛋白和疏水性强的蛋白,是对2D技术的一个必要补充。,液相等电聚焦仪根据蛋白质等电点的不同将其分离，这项功能强大的非变性技术可快速、简单而有效地从复杂蛋白混合物
8、中纯化分离出低丰度蛋白质，快捷的收集已分步分离的样品，合并或富集，甚至可以对初步分离的样品进行再分离。对于那些难溶、不溶性蛋白或者不能通过以等电聚焦原理为基础的胶分离手段的样品，使用液相等电聚焦是非常有效的实验方法。,根据实验流程介绍相关仪器,二、样品定量,RC DC Protein Assay 蛋白定量试剂盒,SmartSpecPlus核酸蛋白测定仪,根据实验流程介绍相关仪器,三、双向电泳第一向Protean i12IEF等电聚焦仪,主要特点,每个泳道可独立控制 这意味着： 不同的样品 不同的方法 不同的pH梯度 Bio-Rad 是唯一可以提供独立泳道控制的IEF系统,价值所在,每个泳道独立
9、控制 优点：节省时间 减少优化试验条件需要的运行次数 同时可运行多个试验 优点：保证试验质量 个别不良样品不会使整个试验失败 更好的重复性 原因? 可对每个泳道设定最大电流 传统的IEF是对所有泳道设定一个总的最大电流 如果同一次运行过程中样品的导电性能差别较大，可造成电流在各个泳道内分布不均 PROTEAN i12 IEF : 为每一泳道设定独立的电流限制，避免了样品间的相互影响，提高试验重现性和一致性。,传统IEF：每个泳道的电流都受到其他泳道内样品影响都受到其他泳道内样品影响,60A,140A,100A,100A,传统 IEF,PROTEAN i12 IEF,等电聚焦原理:,在第一向分离
10、中蛋白质先按其等电点不同分开（isoelectric point pI值）。pI值就是使蛋白质不带净电荷，且在电场中不发 生迁移的特定pH值。这项将蛋白质按其等电点分离的技术称为 等电聚焦。,+,pH 3,pH 7.5,pH 10,1-D Electrophoresis,The 1st D: Isoelectric Focusing,ReadyPrep IPG Strips,根据实验流程介绍相关仪器,四、双向电泳第二向SDS-PAGE,SDS-PAGE,pH 3,pH 7.5,pH10,charge,size,The 2nd D: SDS-PAGE,Proteins migrate throu
11、gh the gel at a rate proportional to their size. Smallest proteins travel the furthest distance,pI,M.Wt.,2-D Electrophoresis,根据实验流程介绍相关仪器,五、染色,Image analysis,六、图像的采集及分析,PDQuest分析流程：,PDQuest,Intuitive Spot Detection Wizard,Excision / digestion,七、切胶质谱前处理 差异蛋白点的切取 脱色 胶内酶解 肽片断提取 点样 质谱分析 数据库比对进行鉴定 手工切胶的缺点： 低丰度蛋白无法准确切取 非密闭系统,污染无法避免 角蛋白污染 其它杂质污染 工作时间长,全自动蛋白切取仪 可切取的范围广泛，速度快，精度高，避免污染。,Mass spectrometry,MALDI-ToF-MS,八、质谱分析,根据实验流程介绍相关仪器,九、验证WesternBlot（免疫印迹法）,Semi Dry,湿转 半干转印 全能型转印,根据实验流程介绍相关仪器,ChemiDocMP全能型凝胶成像系统,The End!,