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1、第34卷第2期南京林业大学学报(自然科学版)V0134，No22010年3月Journal of Nanjing Forestry Univemity(Natural Science Edition)Mar，2010枸杞中黄酮类化合物纯化工艺的研究贾韶千，吴彩娥，杨剑婷，李婷婷(南京林业大学森林资源与环境学院，江苏南京210037)摘要：采用静态吸附法筛选适合纯化构杞黄酮类化合物的大孔树脂，并优化其动态吸附纯化工艺。静态吸附纯化试验表明：供试4种大孔树脂中，HPD一100对枸杞中黄酮类化合物吸附量最高，解吸率达到8215。动态吸附纯化试验表明：上样浓度为50 mgmL、上样流速为20 mLmi
2、n、洗脱液乙醇质量分数为50、洗脱速度为15 mLmin时，构杞总黄酮的纯度为7853，回收率达7135。关键词：枸杞；黄酮类化合物；大孔树脂；纯化中图分类号：霞551文献标志码：A文章编号：10002006(2010)02008504Purification process of total flavonoids in Lycium barbarumLJIA Shaoqian，WU Caie，YANG Jian-ring，LI Tingting(Cofiege of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry University，Na
3、njing 210037，China)Abstract：The optimum macroporous resins for purification of flavonoids in Lycium barbarum Lwere screened by static adsorption method11le purification process of flavonoids in L barbarum Lwa$optimized through dynamic adsorption experimentT11fstatic adsorption results showed that ma
4、eroporous resin HPD一100 had a hi【ghest adsorption in the four types of ma(ro|)orous resinsand its adsorption rate reached 8215r11le dynamic adsorption results showed that whenthe injecting velocity，injecting concentration，elution solution concentration and eluting velocity were 20 mErain，50 mgmL，50e
5、thanol and 15mLmin，respectivelyn地purity of the total flavonoids achieved 7853and therecoveryreached 7135Key words：Lycium barbarum L；flavonoids；macroporousresin；purification枸杞(蛳撕barbarum L)为多年生灌木。枸同型号的大孑L树脂，对枸杞中黄酮类化合物的纯化杞中含有丰富的多糖、氨基酸、黄酮类化合物、矿物效果进行研究，目的是寻找一种适合枸杞黄酮类化质等，具有滋补肝肾、益面色、长肌肉、坚筋骨之合物纯化的大孑L树脂，并研究
6、适宜的纯化工艺，为效【l。2。枸杞中黄酮类化合物可止咳、平喘、祛痰，枸杞的产业化开发提供一定的理论依据。并能扩张冠状动脉及降低血胆固醇，有增强心脏收1材料与方法缩、减少心脏搏动数及清除自由基等作用“1。目前，关于枸杞中黄酮类化合物纯化的报道很少。大11试验材料及处理孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、吸附容量大、供试材料巾枸杞购自宁夏中宁县。芦丁标准品选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方产自国药集团化学试剂有限公司。试验试剂有亚硝便、使用周期长、节省费用等优点，现已大量用于环酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、石油醚(均为分析保、化工、医药和食品工业b-6。笔者选用4种不纯)。大孔树脂型号
7、为AB一8、D一101、HPD一100、收稿日期：20090518修回日期：2009一11一12基金项目：南京林业大学引进高层次人才科研基金项目(G2006一1)作者简介：贾韶千(1983一)。博t生。吴彩娥(通信作者)：教授。E-mail：sxwueaie163com。引文格式：贾韶千，吴彩娥，杨剑婷，等枸杞中黄酮类化合物纯化工艺的研究J南京林业大学学报：自然科学版，2010，34(2)：8588，万方数据86南京林业大学学报(自然科学版)第34卷HPD一600沧州宝恩化工有限公司生产。试验仪器有玻璃层析柱(16 mm500 mm)、，IU一1800PC紫外可见光光度计、QT一58A紫外智能
8、检测仪、BSZ一100自动部分收集器、调速多用振荡器HY一4、旋转蒸发仪RE一52。枸杞经烘干、粉碎后过0266 mm筛。准确称取枸杞粉末100 g，用石油醚脱脂处理l h，超声提取得总黄酮提取液，抽滤，旋转蒸发至100 mL，真空干燥得枸杞黄酮粗提物，备用。将经过浸泡的大孔吸附树脂装柱，用70乙醇洗脱2 h，然后悄双蒸水洗涤层析柱，直至洗出液无醇味，即可使用。12静态吸附与解吸试验将枸杞提取液经减压浓缩、干燥，得到晶状粉末。准确称取一定量枸杞提取物粉末，溶于一定体积的蒸馏水中(例如，将10 mg粉末溶于10 mL蒸馏水中，得10 mgmL的总黄酮水溶液)，进行纯化试验。准确称取预处理过的HP
9、D一100、HPD一600、AB一8、D一10l型大孔吸附树脂各50 g，置于磨口三角瓶中，分别加入100 mL质量浓度为50 mgmL的黄酮水溶液在摇床上震荡，振荡频率为160 rmin。每隔一定时间，测定溶液中的黄酮浓度，计算吸附量7|。在按上法充分吸附后的树脂中加入70乙醇 100 mLl8 J，浸泡振摇12 h，过滤，测定滤液黄酮浓度，根据吸附量计算解吸率，计算公式见文献7 8。根据吸附量和解吸率筛选出纯化效果最好的大孑L吸附树脂。13动态吸附试验及各因素对纯化效果影响的测定将预处理过的HPD一100型树脂装入层析柱，黄酮水溶液以20 mLmin的流速上样，上样质量浓度为20 mgmL
10、，按10 mL管收集流出液，测定各管中黄酮类化合物的浓度，直到流出液中黄酮浓度与上样液中黄酮浓度相同，得到动态吸附的穿透曲线。按上述方法上样，达到吸附饱和后，以蒸馏水洗柱，然后用50乙醇以10 mLmin的流速洗脱，按50 mL管收集流出液，测定各管中黄酮类化合物的浓度，直到流出液浓度基本不变，得出动态洗脱的动力学曲线。动态吸附试验中同时测定上样浓度、流速、洗脱液浓度及洗脱速度对纯化效果的影响。上样浓度测定时，将预处理过的HPD一100型树脂装入层析柱，不同浓度的总黄酮水溶液以20 mLmin的流速上样，当达到吸附饱和时，停止上样，收集流出液，测定黄酮类化合物的浓度。上样流速测定时，将浓度为5
11、0 mgmL的总黄酮水溶液以不同流速上样，当达到吸附饱和时，停止上样，收集流出液，测定黄酮类化合物的浓度。洗脱液浓度测定中HPD一100树脂层析柱吸附饱和时，先用水洗脱至洗脱液为无色，然后用不同浓度的乙醇以10 mLmin的流速洗脱，分管收集流出液，测定黄酮类化合物的浓度，计算洗脱率。洗脱速度测定中HPD一100树脂层析柱吸附饱和时，先用水洗脱至洗脱液为无色，然后Hj体积分数为50的乙醇以不同的流速洗脱，分管收集流出液，测定黄酮类化合物的浓度，计算洗脱率。吸附量和洗脱率的计算方法见文献78。14指标的测定(1)黄酮含量。精密称取120干燥至恒定质量的芦丁标准品100 mg，加80乙醇溶解，定容
12、至50 mL容量瓶中，摇匀，制成02 mgmL的标准品溶液。分别取该溶液00、02、05、10、20、30、40 mL于10 mL容量瓶中，加5亚硝酸钠04 mL，放置6 min，加10硝酸铝04 mL，放置6 min，再加4氢氧化钠4 mL，加水至刻度，摇匀。放置15 min，在510 nm处测定其吸光度值。以标准样品浓度为横坐标。吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线【9 J。计算得吸光度A对浓度C的线性回归方程为：A=1 1574C一0001 1，R2=0999 8，在40800gmL范围内呈良好的线性关系。一定体积总黄酮溶x=液中址总黄等酮含量铲的计。算公式如下：其中：x为总黄酮含量，mg；A
13、为吸光度值；V为总黄酮溶液的体积，mL。(2)黄酮纯度。将纯化前后的黄酮溶液分别减压浓缩、干燥，得到总黄酮粉末。准确称取纯化前后的总黄酮粉末各100 mg，分别溶于80乙醇溶液并定容到100 mL。各吸取2 mL于10 mL容量瓶中，按黄酮含量测定方法进行测定(平行测定5次求平均值)，再根据公式计算提取物中的黄酮纯度：提取物中总黄酮纯度=告100。其中：x为总黄酮含量，mg；M为称取总黄酮粉末的质量，mg。回(3)收总黄率酮同=收业率。雩措铲x100。万方数据第2期贾韶千，等：枸杞中黄酮类化合物纯化T艺的研究87加O2结果与分析”521静态吸附及解吸试验结果4种树脂静态吸附曲线如图1所示。从图
14、10可以看出，在静态吸附80min时，4种树脂都已达帖5到吸附饱和。在吸附的初始阶段，随着时间的延长，吸附量的增加非常明显，之后曲线趋于平缓，直到吸附饱和。从图中可以明显看出，HPD一100型大孔吸附树脂的静态吸附量高于其他3种树脂。口oI苦扫葺ou口ou葛等go一。一g)，莓I璐卿世挺毛鹾O。406080100120140160180200流出液体,rtgJmLvolume ofemuentJHPD一100型大孑L树脂为非极性，比较适合枸杞黄葛叠酮的吸附，且HPD一100型大孔树脂的比表面积最萋l大，更有利于枸杞黄酮的吸附【l。鞋40鲢专产馨曲媚hE洗脱液体积,JmL咖口。口dl口焉莲vol
15、ume ofeluent督 10图2动态吸附曲线0时I圃raintime图1静态吸附曲线Fig1The curve ofstaticadsorption按以上方法充分吸附后的树脂，加入100 mL 体积分数70的乙醇，浸泡振摇12 h，过滤，测定滤液中黄酮浓度。经计算，HPD一100、HPD一600、AB一8、D一101型树脂的解吸率分别为8215、7881、7946、7643。HPD一100型树脂的解吸率在4种树脂中为最高。选取高吸附率和解吸率的树脂可以提高纯化效率，达到最好的纯化效果。根据吸附量和解吸率的大小，选择HPD一100型的大孔吸附树脂进行动态吸附试验。22动态吸附穿透曲线及解吸曲
16、线动态吸附过程中，树脂的穿透曲线如图2A，解吸曲线!J；已图2B。从图2A可以看出，流出液体积在40 mL时，总黄酮提取液开始流出，当流出液体积达到130 mL 后，流出液浓度和上样浓度基本一致。这说明，树脂此时已经达到吸附饱和，经计算，动态吸附的吸附量为2635 mgg。从图2B中可以看出，洗脱液体积在50 mL时黄酮类化合物开始被洗出，之后洗脱液浓度迅速升高，洗脱液体积达到120 mL后，黄酮类化合物已基本洗脱完全。从图2B还可以看出，洗脱时有拖尾现象，但是并不严重，这说明可以用50的乙醇进行洗脱。Fig2The alrve of dynamic adsorption23上样浓度和流速对吸
17、附效果的影响当上样质量浓度为50 mgmL时，树脂的吸附量最高(表1)。上样浓度太高或太低时，树脂的吸附量都不高。当上样浓度较低时，树脂需要经过较长时间才能达到吸附饱和，所以吸附效率较低1；而上样浓度太高，则黏度较大，枸杞黄酮向树脂内部的传质速度慢，部分黄酮还未被树脂吸附就流出来，造成上样液的浪费【l 2|。因此选择提取液质量浓度为50 mSmL进行上样效果较好。表1上样浓度和流速对吸附效果的影响Table 1Effects of the mjecting concentration and velocityonthe adsorption上样质量浓度吸附量上样流速吸附量(mgml。一1)(m
18、gmL。1)(ml，rain+1)(mgmi11)injecting concentrationadsorptioninjecting velocityadsorption1O2085O530832025371030413027391530024O28852029855O3I6725274860299l3O26197O2878352508402487调节恒流泵的流速，考察不同上样流速对吸附效果的影响，结果见表l。从表l可知，随着上样流速的提高，树脂的吸附量呈下降趋势。这是因为，流速太快时，上样液还未被树脂完全吸附就已通过层析柱，使树脂的吸附效率降低；但是上样速度越慢，所需的上样时间就越长。影响
19、整体的纯化万方数据南京林业大学学报(自然科学版)第34卷效率n 3|。综合考虑，选择20 mLmin为最佳上样流速。24 乙醇体积分数和洗脱速度对洗脱效果的影响不同体积分数乙醇对黄酮的洗脱能力不同(表2)。表2乙醇体积分数和洗脱速度对洗脱效果的影响Table 2Effects of concentration and eluting velocity ofethanol solutionontheelution乙醇体积分数洗脱牢燃(mLnfn-i) 洗脱率concentrationrate of elufioneluting velocityrate of elution206208O5923
20、6306993109128408597159050509236208429608954257613708439307195357002406108从表2可以看出，随着乙醇体积分数升高，洗脱率明显升高。但当乙醇体积分数超过50后，洗脱率开始下降。当乙醇体积分数为50时，洗脱率最高。这可能是因为黄酮类化合物具有一定的极性，当乙醇体积分数合适时，乙醇溶液的极性与黄酮类化合物的极性最接近，根据相似相溶原理，此体积分数的乙醇对黄酮类化合物的溶解能力最强，所以体积分数为50的乙醇洗脱率达到最佳引。不同洗脱速度对洗脱效果的影响显著(表2)。由表2可明显看出，随着洗脱速度的升高，洗脱率明显下降。这是因为，流速
21、太快时，洗脱液还未充分的溶解被树脂吸附的黄酮类化合物，就已经通过层析柱，导致洗脱率不高；而洗脱速度太慢，则需要越长的洗脱时间，影响洗脱效率5|。综合考虑，选择15 mLmin为最佳洗脱速度。25纯化前后黄酮的纯度根据计算得出纯化前、后的总黄酮纯度分别为2157和7853，总黄酮回收率为7135。经过纯化后，总黄酮的纯度提高近4倍。3结论从吸附量和洗脱率等方面考察了大孔吸附树脂对枸杞总黄酮的纯化效果。通过静态吸附试验对4种大孔吸附树脂对枸杞总黄酮的吸附分离特性进行考察，确定HPD一100型大孔吸附树脂对枸杞总黄酮具有良好的吸附效果。由动态吸附试验确定其最佳工艺为：上样质量浓度50 mgmL，上样
22、流速20 mLmin，洗脱剂体积分数50，洗脱速度15 mLrain。经计算得出吸附量为3075 mgg，洗脱率为905。纯化后所得样品的纯度为7853，与粗提物纯度(2157)相比，提高近4倍。应用HPD一100型大孑L吸附树脂纯化枸杞总黄酮，方法简单，纯化效果好，回收率高，具有良好的应用前景。参考文献：1薛市文，李以暖枸杞子的营养和保健功能J广东微鼍元素科学，2000，7(6)：I一42宋国安枸杞籽的药用保健价值与开发前景J中国食物与营养2005，7：26283朱燕飞枸杞子药理作用概述J浙江中西医结合杂志，2005。15(5)：3223234王平枸杞千的现代研究与临床新用途【J中国中医基础
23、医学杂志，2000，6(12)：41425】王跃生，王洋大孔吸附树脂研究进展J中国中药杂志，2006，31(12)：96l一965【6Xiang D X，Li H D，Zhu Y cStudies on separation and purifi cation of total flavoniods from Radix puerariae by mxoreficularadsorbentsJChin Pham J，2003，l(38)：35377麻秀萍，蒋朝晖，杨玉琴，等大孔吸附树脂对银杏叶黄酮的吸附研究【J】中围中药杂志。1997，22(9)：5395428黄丽容，陆金环，谭健星，等AB一
24、8大孔吸附树脂纯化降香总黄酮的I=艺研究J广东药学院学报，2006，22(3)：2702719张自萍，黄文波枸杞总黄酮和多糖的超声提取及含量测定J农业科学研究，2006，l(27)：222410潘见。陈强，谢慧明，等大孔树脂对葛根黄酮的吸附分离特性研究J农业T程学报，199915(I)：23624011Hou S x，Tian H KThe application of separation and purificationplOC$of compound in TCM by ffmeroporousadsorption resinJTradit ChinaDrug Res Clin Pharmac012000，ll(3)：131133【12韩博，陈文，景文娟，等AB一8大孔吸附树脂对甘草总黄酮的吸附J南方医科大学学报，2007，27(3)：26526713潘廖明，姚开，贾冬英，等大孑L树脂吸附大豆异黄酮特性的研究J食品与发酵T业，2003，29(5)：15一1814冯涛竹叶总黄酮提取及纯化工艺的研究D天津：天津科技大学200315赵骏，张杰大孑L吸附树脂对荷叶黄酮苷的吸附纯化应用【J中药材，2005，28(9)：832834(责任编辑郑琰羰)万方数据