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1、实验一 质粒提取及酶切鉴定,基因工程（genetic engineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。,相关基础知识,目的基因 工具酶 载体,基因工程相关物质,质粒 存在于细菌细胞内、染色体外、共价闭合的 小型环状DNA分子(covalent closed circular DNA)。 具有自我复制功能。 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物 经改造后具有多克隆位点。,质粒 (plasmid) 特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状,限制性核酸内切酶： -基因工程的手术刀 是分子
2、生物学研究中的一种工具酶，能识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 如：EcoR和Hind的识别序列和切口是： EcoR：GAATTC Hind：AAGCTT,概念,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统（restriction-modification system），限制外源DNA， 保护自身DNA。,作用,分类,酶结构、作用、识别及切割特异性的不同 分为、，基因工程技术中常用型 型酶具有限制和DNA修饰作用，且识别及切割位点不同（下游100-1000bp） 型酶具有限制和DNA修饰作用，识别及切割位点不同（相距较近）,（1）识别及切割位点相同 （2）识别序
3、列通常为48bp的回文结构； （3）切割可产生两类切口，三种末端。,型限制酶特点,型酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,钝性末端,粘性末端,质粒提取原理,质粒的提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在碱性环境中，线性的大分子细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；,溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀
4、出来，而质粒DNA则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。 由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。,Relaxed circle,Linearized form,Super-coiled form,与DNA分子量标准物（Marker）比较能大概判断未知DNA的分子量 质粒DNA为环状，在酶切彻底的情况下，DNA片段数与酶切位点数目相同,质粒DNA酶切鉴定的原理,Marker,质粒DNA过夜酶切,操作步骤(Methods),分组：4人/组，每组提取两种质粒（空载及重组质粒） 1.质粒的提取 （1）接种一个单菌落（single colony）于5 mL含相
5、应抗生素的LB培养基中，37振荡培养至饱和状态（A600=0.4）或过夜。（教师准备）,（2）取1.5 mL离心管一支，加入1.4 mL菌液，13 000 r/min离心1 min去掉上清液。加入150 L 的溶液，充分混悬细菌，在室温下放置10 min。 （3）加入200 L新配制的溶液。加盖，颠倒5次使之混匀。冰上放置5 min。 （4）加150 L预冷的溶液，加盖后颠倒5次混匀，冰上放置15 min。13 000 r/min离心5 min，取400 L上清液移入另一离心管中。,（5）向上清液中加入等体积苯酚/氯仿，震荡混匀，13 000 r/min离心2 min，300 L上清液转移至新的离心管中。 （6）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置2 min。离心5 min，倒去上清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 （7）加入1 mL 70 %乙醇，震荡并离心， 13 000 r/min离心2 min，倒去上清液，晾干，加入20 L的 TE缓冲液，使 DNA完全溶解，待用。,2.质粒DNA的酶切鉴定,取一只1.5mL EP管加入以下试剂： 酶切混合液：15 L 质粒DNA：5 L 混匀后，置37 过夜保温，反应结束后4 放置备用。,