荧光定量PCR检测恶性转化人脐带间充质干细胞中DNA甲基化转移酶的改变.doc

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1、荧光定量PCR检测恶性转化人脐带间充质干细胞中DNA甲基化转移酶的改变 导读：就爱阅读网友为您分享以下“荧光定量PCR检测恶性转化人脐带间充质干细胞中DNA甲基化转移酶的改变”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持!中国组织工程研究 第21卷 第21期 20170728出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research July 28, 2017 Vol.21, No.21 www.CRTER.org 荧光定量PCR检测恶性转化人脐带间充质干细胞中DNA甲基化 转移酶的改变 ，研究原著 陈业增1，唐秋灵1，陈秋蓉1，赖秀蓝12，邱晓燕1，郑泽鑫

2、1，李伟中1(汕头大学医学院第二附属医院，1儿科，2转化医学中心，广东省汕头市 515041) 引用本文：陈业增，唐秋灵，陈秋蓉，赖秀蓝，邱晓燕，郑泽鑫，李伟中. 荧光定量PCR检测恶性转化人脐带间充质干细胞中DNA甲基化转移酶的改变J.中国组织工程研究，2017，21(21):3320-3325. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.007 ORCID: 0000-0003-0620-0591(陈业增) 文章快速阅读： 荧光定量PCR检测恶性转化人脐带间充质干细胞中DNA甲基化转移酶改变 干预： 分离培养纯化： 3- 人脐带间充质干细胞 甲基胆蒽诱导人

3、脐带间充质干细胞恶性转化 二甲基亚砜诱导1周 BALB/c裸鼠皮下种植 肿物组织培养细胞 荧光定量RT-PCR检测DNA甲基化转移酶表达 肿物苏木精-伊红染色 文题释义： 干细胞恶性转化：干细胞可能是多种缺陷和疾病的理想治疗方案，这将在可以预见的未来中发挥其远大的应用前景。但是安全性目前仍有待检验，在临床应用前，必须首先解决其安全性问题。而干细胞恶性转化是其临床应用第一大障碍，在临床应用前找到对其恶性转化的有效监测方法是目前亟需解决的问题。实验主要探讨采用荧光定量RT-PCR进行批量检测的可行性。 DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)：DNA 甲基化主要

4、由DNA甲基转移酶催化，根据N端蛋白结合区域的结构差异，可分为3类：DNMT1、DNMT2和DNMT3a和DNMT3b，以及最近报道的DNMT3L。其中发挥着最为重要作用的是DNMT1、DNMT3a、DNMT3b。DNMT家族表达的升高在癌症进展过程中可能起重要作用，导致了许多重要抑癌基因甲基化的异常。 摘要 背景：根据体外培养的成体干细胞自发恶性转化现象及肿瘤干细胞理论，人脐带间充质干细胞在体外培养过程中可能产生变异，体内移植后可能存在致瘤性风险。因此，建立健全的体外安全性检测程序，将在干细胞临床应用上起积极推动作用。 目的：探讨人脐带间充质干细胞致瘤性机制及DNA甲基化转移酶的表达水平。

5、方法：采用组织块贴壁法分离、培养、扩增出人脐带间充质干细胞，利用3-甲基胆蒽促使人脐带间充质干细胞发生恶性转化，通过形态学观察，裸鼠成瘤实验进行验证，成瘤组织进行病理学鉴定、原代细胞培养，荧光定量PCR检测人脐带间充质干细胞与肿瘤细胞DNA甲基化转移酶表达水平的差异。 结果与结论：人脐带间充质干细胞经3-甲基胆蒽处理后形成恶性转化细胞，呈恶性生长，细胞核型呈非整数倍体改变，注入裸鼠体内后能形成恶性肿物；经荧光定量PCR检测，恶性转化后肿瘤细胞(实验组)相比二甲基亚砜培养人脐带间充质干细胞(对照组)，其DNA甲基化转移酶的基因表达量明显增高；结果表明，人脐带间充质干细胞在一定条件下能发生恶性转化

6、，包括形态学变化及表观遗传学层面改变，DNA甲基化转移酶可作为预防干细胞移植后成瘤的进一步研究方向。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；人脐带间充质干细胞；恶性转化；DNA甲基化；DNA甲基化转移酶 主题词： 脐带；间质干细胞；甲基胆蒽；细胞转化, 肿瘤；DNA甲基化；组织工程 基金资助： 广东省医学科学技术研究基金(B2013276) 3320 P.O. Box 10002, Shenyang 陈业增，男，1987年生，广东省汕头市人，汉族，2012年汕头大学毕业，硕士，主治医师，主要从事干细胞研究。 通讯作者：李伟中，主任医师，汕头大学医学院第二附属医院儿科，广东省汕头市 515041 中

7、图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2017)21-03320-06 稿件接受： 2017-03-06 Chen Ye-zeng, Master, Attending physician, Department of Pediatrics, the Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical School, Shantou 515041, Guangdong Province, China Corresponding author: Li Wei-zhong, Chief physicia

8、n, Department of Pediatrics, the Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical School, Shantou 515041, Guangdong Province, China www.CRTER.org 110180 陈业增，等. 荧光定量PCR检测恶性转化人脐带间充质干细胞中DNA甲基化转移酶的改变 www.CRTER.org Quantitative real-time PCR detection of DNA methylation transferase in the maligna

9、ntly transformed human umbilical cord mesenchymal stem cells Chen Ye-zeng1, Tang Qiu-ling1, Chen Qiu-rong1, Lai Xiu-lan1, 2, Qiu Xiao-yan1, Zheng Ze-xin1, Li Wei-zhong1 (1Department of Pediatrics, 2Transforming Medical Center, the Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical School, Shan

10、tou 515041, Guangdong Province, China) Abstract BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) may be mutated during in vitro culture based on the spontaneous malignant transformation of adult stem cells and tumor stem cell theory, and there may be a risk of tumorigenesis after i

11、n vivo transplantation. Therefore, to establish and perfect the in vitro safety testing procedures will actively promote the clinical application of stem cells. OBJECTIVE: To investigate the tumorigenic mechanism of hUC-MSCs and the expression level of DNA methyltransferase (DNMTs) in hUC-MSCs. METH

12、ODS: Primary hUC-MSCs were isolated and expanded by tissue adherent culture. 3-Methycholanthrene was used to cause the malignant transformation in hUC-MSCs (experimental group), followed by morphological observation and tumorigenesis experiment in nude mice. Then, the tumor tissues were obtained and

13、 identified by pathological examination and primary cell culture, and the levels of DNMTs mRNA in hUC-MSCs treated with 3-methycholanthrene and dimethyl sulfoxide (control group) were detected by real-time RT-PCR and compared. RESULTS AND CONCLUSION: hUC-MSCs treated with 3-methycholanthrene led to

14、malignant transformation, which showed malignant growth and non-integer ploidy changes in the cell nuclei, and formed a malignant tumor in immune-deficient mice after injection. Compared with the control group, the cells in the experimental group showed higher expression of DNMTs mRNA as detected by

15、 real-time RT-PCR. To conclude, hUC-MSCs can trigger malignant transformation in the morphology and the epigenetics under certain conditions. DNMTs can be a candidate for prevention against malignant transformation of transplanted stem cells. Subject headings: Umbilical Cord; Mesenchymal Stem Cells;

16、 Methylcholanthrene; Cell Transformation, Neoplastic; DNA Methylation; Tissue Engineering Funding: the Medical Science and Technology Research Foundation of Guangdong Province, No. B2013276 Cite this article: Chen YZ, Tang QL, Chen QR, Lai XL, Qiu XY, Zheng ZX, Li WZ. Quantitative real-time PCR dete

17、ction of DNA methylation transferase in the malignantly transformed human umbilical cord mesenchymal stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(21):3320-3325. 0 引言 Introduction 研究表明，人脐带间充质干细胞具有多向分化潜能，能向3个胚层细胞分化1-3，是替代疗法、细胞移植和基因治疗首选的种子细胞之一。人脐带间充质干细胞具有低免疫原性及组织损伤修复功能，易于获得、分离、体外扩增及进行遗传修饰，已经在许多

18、疾病中展开了积极的研究，并在部分疾病研究中达成了一定的治疗预期4-12，但在治疗开展中仍存在许多安全性等问题亟待解决。体外培养过程中，人脐带间充质干细胞的基因表达、分化能力、扩增潜能和免疫表型方面可能发生显微镜难以发现的变化。随着研究的深入，一些研究者相继报道了干细胞在体外长期培养后会自发恶性转化13-14，课题组在前期实验中也发现用3-甲基胆蒽可以诱导脐带间充质干细胞发生恶性转化15，体外培养的干细胞成瘤性风险是其进一步临床应用的一大阻碍。实验将对其恶性转化的原因进行分析，希望探明其成瘤性机制。 医院出生的健康足月新生儿(产妇及家属已放弃使用权)。 1.3.2 主要试剂 高糖DMEM培养基、

19、DMEM培养基、F-12培养基(美国GIBCO公司)；重组表皮生长因子、重组碱性成纤维生长因子(美国Sigma公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；RT-PCR试剂盒RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0(日本Takara公司)；胰蛋白酶(碧云天生物技术有限公司)；DAPI(美国Sigma公司)；RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒(日本Takara公司)；SYBR? Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)(日本Takara公司)；RNAiso Plus(日本Takara公司)。 1.3.3 实验动物 选取4-6周龄雌性BALB/c裸

20、鼠6只为研究对象，体质量15-20 g，SPF级清洁动物实验中心培养。此小鼠没有胸腺，因此形成T细胞缺陷，易构建肿瘤模型。由国家啮齿类实验动物种子中心引自日本C.W.Friis第12代，购自广东省医学实验动物中心。 1.4 实验方法 1.4.1 人脐带间充质干细胞的体外培养及鉴定 参照课题组前期研究操作步骤16。 1.4.2 人脐带间充质干细胞的恶性诱导、裸鼠成瘤实验、肿瘤细胞培养及鉴定 参照课题组前期研究操作步骤15。 1.4.3 肿瘤细胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b检测 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 细胞实验研究。 1.2 时间及地点

21、实验于2010至2015年在汕头大学医学院生殖中心实验室完成。 1.3 材料 1.3.1 标本来源 人脐带取自汕头大学医学院第二附属ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 细胞总RNA提取：样本为正常人脐带间充质干细胞(空白对照组)、肿瘤组织原代培养后传至第3代细胞(实验组)，3321 陈业增，等. 荧光定量PCR检测恶性转化人脐带间充质干细胞中DNA甲基化转移酶的改变 www.CRTER.org 以及用二甲基亚砜对照培养的第3代人脐带间充质干细胞(对照组)。各组细胞在长至80%-90%融合度后终止培养，收集细胞，用Takara RNAiso Plu

22、s(Total RNA 提取试剂)提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。 反转录反应：按照TaKaRa公司的反转录反应试剂盒方案，配制反转录反应液，进行反转录反应以合成cDNA。 设计引物：根据 Genebank 中人 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、GAPDH的序列参照 RT-PCR 引物设计原则，设计 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、内参GAPDH 引物序列：DNMT1上游引物：5-CCA TCA GGC ATT CTA CCA-3，下游引物：5-CGT TCT CCT TGT CTT CTC T-3；DNMT3a上游引物： 5-TAT TGA TGA GCG

23、CAC AAG AGA GC-3，下游引物：5-GGG TGT TCC AGG GTA ACA TTG AG-3；DNMT3b上游引物：5-AAT GTG AAT CCA GCC AGG AAA GGC-3，下游引物：5- ACT GGA TTA CAC TCC AGG AAC CGT-3；GAPDH上游引物：5-CCT CTG ACT TCA ACA GCG ACA C-3，下游引物：5-TGG TCC AGG GGT CTT ACT CC-3。 荧光定量Real-time PCR反应：在PCR反应体系中加入荧光染料如SYBR Green ，并通过real time PCR检测系统对PCR反

24、应进程中的荧光信号强度进行实时监测，最终通过Ct值对起始模板进行定量及定性分析。SYBR Green 荧光染料法定量PCR的基本过程是：开始反应，当SYBR Green 染料与DNA双链结合时发出荧光；DNA变性时，SYBR Green 染料释放出来，荧光急剧减少；在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物；聚合完成后，SYBR Green 染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。实验步骤：按照TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTM RT-PCR 说明书要求，配置荧光定量PCR反应体系，然后按荧光定量PCR扩增标准程序(第一步：预变性，参数：1-95 30

25、s。第二步：PCR反应，参数：40-95 5 s，60 31 s；熔解阶段)。 采用2-?Ct法，根据定量PCR所得到的Ct值(*)计算目的基因的相对表达量，公式如下：?Ct=目的基因Ct值- GAPDH Ct值，?Ct=实验组?Ct-对照组?Ct，实验组目的基因/对照组目的基因=2-?Ct；*Ct=循环数(c)+阈值(t)的第一个英文字母，就是表示当所检测的荧光值刚超过荧光阈值的时候，该反应到达的循环数。 以二甲基亚砜对照培养的第3代人脐带间充质干细胞为对照组，进行数据分析。结果判定：将每个样品的Ct值与GAPDH的Ct值相比，得到的相对比值用来反映目的基因mRNA表达水平。Ct值越小，说明

26、达到设定阈值所需的循环数越多，代表起始cDNA浓度越高，即对应的mRNA表达水平越高；Ct值越大，说明起始cDNA浓度越低，即对应的mRNA表达水平越低。 1.5 主要观察指标 恶性转化的人脐带间充质干细胞的生物学特征；恶性转化的人脐带间充质干细胞成瘤后3322 肿瘤细胞生物学特征；荧光定量RT-PCR检测人脐带间充质干细胞、肿瘤细胞DNMTs的表达。 1.6 统计学分析 对荧光定量PCR结果进行统计学分析，其中恶性转化细胞的3种甲基化转移酶mRNA表达差异采用t 检验，3种甲基化转移酶之间的比较采用单因素方差分析(one way anova)，P 2 结果 Results 2.1 人脐带间充

27、质干细胞和恶性转化的人脐带间充质干细胞的生物学特征 采用组织块贴壁法进行原代培养 5-7 d，部分组织块贴壁，周围可见大量细小成纤维样细胞爬出，传代后人脐带间充质干细胞呈成纤维细胞样贴壁生长，第1代细胞生长较慢，继续传代后细胞生长速度变快。当细胞达90%左右融合时，可将细胞按梯度冷冻法将细胞冻存于-80 冰箱内，3个月内这些细胞复苏后的存活率至少达50%左右。此方法所得细胞即为人脐带间充质干细胞。 课题组前期研究已证实人脐带间充质干细胞具有间充质干细胞的表面标志，CD10、CD13、CD29、CD44、CD90、CD166、CD106、SH2(CD105)及人淋巴细胞位点1抗原(HLA-1)均

28、阳性，其中CD106、SH2(CD105)及HLA-1表达低于骨髓间充质干细胞，表明人脐带间充质干细胞具有更原始的间充质干细胞群；CD14、CD33、CD56、CD31、CD34、CD45及人淋巴细胞位点DR抗原(HIA-DR)均阴性18。 9批实验组经3-甲基胆蒽诱导后的人脐带间充质干细胞中，8批细胞10代(约30 d)至20代(最长约60 d)陆续凋亡，仅1批在经过32代传代后细胞生长分裂速度较前加快，传代效率明显提高。镜下观察出现细胞聚团现象，细胞出现相互重叠，甚至向三维空间发展，形成堆积的细胞团块。这些表明细胞在恶性诱导后出现了细胞特性改变，增长速度、自我更新性能都产生变化(图1A)。

29、而对照组加入二甲基亚砜培养的人脐带间充质干细胞经过长期传代培养，特别是在第8，9代之后，细胞逐渐出现老化，表现为细胞状态、生长分裂速度、传代效率等缓慢降低，再经过数次传代后逐渐出现生长停滞、凋亡现象(图1B)。 2.2 恶性转化的人脐带间充质干细胞成瘤后肿瘤细胞生物学特征 将以上恶性转化人脐带间充质干细胞注射裸鼠皮下，约2个月后注射部位出现包块(图2)，病理解剖呈鱼肉状。病理切片(苏木精-伊红染色)可见大量核分裂相，异型性高(图3)。课题组前期研究显示其免疫组织化学中各抗体结果：Ki-67(+)，结合苏木精-伊红染色结果，推断为恶性肿瘤细胞，恶性程度高；Vim(+)，CK()和EMA(-)，提

30、示细胞间叶来源，肉瘤可能性大；NF(+)和NES(+)，提示细胞神经来源可能性大，不排除低分化癌细胞向神经细胞发展。肿瘤细胞进行常染色体G显带分析，可见其染色体形态呈人染色体形态，染色体数量波动在61-69，呈多倍体，具有某些肿瘤细胞染色体特征17。 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org 陈业增，等. 荧光定量PCR检测恶性转化人脐带间充质干细胞中DNA甲基化转移酶的改变 www.CRTER.org 2.3 肿瘤细胞原代培养结果 取部分肿瘤组织行原代培养，原代细胞很快爬出，细胞生长分裂迅速(图4A)，细胞传代到生长至90%融合度所需时间缩短

31、为两三天，而且由于生长速度快，肿瘤细胞在培养瓶中培养时极易出现细胞聚团现象，细胞形态、生长状态均具有肿瘤细胞特性(图4B)。 2.4 荧光定量RT-PCR检测人脐带间充质干细胞、肿瘤细胞DNMTs的表达 2.4.1 总RNA 提取及纯度鉴定 取80%-90%融合度的二甲基亚砜对照培养的第3代人脐带间充质干细胞，以及肿瘤组织培养传代第3代细胞，用Takara RNAiso Plus提取总RNA。提取后采用核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度，测吸光度值，所有样本RNA提取物A260/A280在1.8-2.0之间，表明提取的总RNA纯度较高，蛋白质及酚去除较干净。 2.4.2 熔解曲线分析 每次实时

32、定量PCR反应结束后，可得到扩增样本的熔解曲线。每个样本的熔解曲线只产生一个熔解峰，全部样本的熔解峰非常接近，熔解峰所在位置的温度为该 PCR 产物片段的熔解温度，表明只产生1种特异性扩增产物(图5)。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为样品基因校正后的相对 含量。 2.4.3 荧光定量PCR结果统计分析 经荧光定量PCR检测，肿瘤组织传代培养第3代细胞(实验组)相比二甲基亚砜培养的第3代人脐带间充质干细胞(对照组)，其DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的基因表达量均明显增高，其中以DNMT1表达量增高最为明显。这些结果均表明人脐带间充质干细胞的恶性转化伴随着3种甲基转移酶DN

33、MT1、DNMT3a、DNMT3b的表达增加(图6)。DNMT1平均呈4.90倍升高，DNMT3a平均呈2.46倍升高，DNMT3b平均呈1.96倍升高，经t 检验，P均3 讨论 Discussion 肿瘤的发生发展是一个多因素、多阶段的复杂过程，其中DNA甲基化与肿瘤发生密切相关17，异常甲基化影响致癌基因与抑癌基因的表达和染色体稳定性。细胞抑癌基ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 因启动子区域CpG岛高甲基化所致的相关基因失活对肿瘤起始及推动发挥重要作用18。DNA甲基化过程有赖于DNMTs的介导，其中DNMT1和DNMT3a、DNMT3b所

34、起的作用尤为重要19-20。 目前已有报道在一些恶性肿瘤中发现DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的过度表达，包括肺癌、前列腺癌、结肠癌、白血病和乳腺癌等21-22。Lin等23研究发现肺癌中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b均出现具有统计学意义的高表达，提示DNMTs高表达可能导致肺癌的发生并具有不良预后。Pathania等24发现DNMT1对于维持正常的乳腺干细胞以及癌症干细胞都非常重要，并且DNMT1在乳腺癌干细胞中表达比正常乳腺干细胞更高。抑制乳腺癌模型中DNMT1的表达能够消除大约80%的肿瘤，特别是侵袭性肿瘤。DNMTs作为哺乳动物DNA甲基转移酶，是生物体生长发育过程中必不

35、可少的酶蛋白。它的异常表达会引起基因甲基化程度的改变从而影响基因的表达。Pathania等25通过核苷类DNMT抑制物5-氮杂-2-脱氧胞苷抑制乳腺癌细胞DNMTs的高水平表达，从而使ISL1抑癌基因重新激活，起到抑癌效果。使用DNMT抑制物治疗实体瘤己逐渐进入早期临床试验的新阶段。 实验旨在利用荧光实时定量PCR技术，检测恶性转化细胞的DNMT1和DNMT3a、DNMT3b基因的表达，观察其对人脐带间充质干细胞恶性诱导的影响。实验结果发现，人脐带间充质干细胞经过3-甲基胆蒽恶性诱导并成瘤扩增后，DNMT1和DNMT3a、DNMT3b基因表达量均明显增高，其中以DNMT1表达量增高最为明显。这

36、些结果均表明人脐带间充质干细胞的恶性转化伴随着3个甲基转移酶的表达增加。究其原因，可能是人脐带间充质干细胞在经过3-甲基胆蒽恶性诱导并长期培养后，细胞基因组中抑癌基因启动子区域出现了异常甲基化，导致细胞抑癌调控失效，从而使人脐带间充质干细胞出现了恶性转化。而细胞在基因层面的变化则表现出与甲基化相关的3种甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b均出现了mRNA表达增高，其中，作为定位于DNA复制启动子甲基化的DNMT1 mRNA表达量较DNMT3a、DNMT3b升高更为明显。 总之，实验首次报道人脐带间充质干细胞恶性转化后3个甲基转移酶表达的改变，结果表明，人脐带间充质干细胞的恶性转化

37、与3种甲基转移酶DNMTs的mRNA表达增加相关，它们将有可能成为对人脐带间充质干细胞恶性转化有价值的筛查和诊断指标，并可能成为人脐带间充质干细胞移植前筛查的重要手段和移植后预防其恶性转化的潜在治疗靶点，为人脐带间充质干细胞及其他类型干细胞临床应用前的安全性检测提供可借鉴的评价模式及恶性转化的预防方法。但客观地说，由于实验样本量相对较小，应谨慎看待这些结果，待进一步的研究收集更多的样本来验证这些结果。 3323 陈业增，等. 荧光定量PCR检测恶性转化人脐带间充质干细胞中DNA甲基化转移酶的改变 www.CRTER.org A B A B 图1 恶性转化的人脐带间充质干细胞的形态 Figure

38、 1 Morphology of human umbilical cord mesenchymal stem cells undergoing malignant transformation 图注：图中A为实验组经3-甲基胆蒽诱导后的人脐带间充质干细胞， 第32代出现生长旺盛，呈螺旋形生长(光镜，100)；B为对照组经 二甲基亚砜培养后传代第9代人脐带间充质干细胞，出现细胞变宽大，透光度较弱，生长状态差，传代效率低下(光镜，200)。 图2 裸鼠成瘤实验 Figure 2 Tumorigenesis experiment in nude mice 图注：健康BALB/c裸鼠颈部或下肢外侧皮肤

39、注射恶性诱导后人脐带间充质干细胞。A为诱导数周后发现BALB/c裸鼠于颈部可见一约 2 cm2 cm2 cm大小包块，质硬，活动度差；B可见包块外血管丰富，切开后见切面呈鱼肉状。 A B A B 图3 BALB/c裸鼠皮下包块苏木精-伊红染色 Figure 3 Hematoxylin-eosin staining of subcutaneous masses of BALB/c nude mice 图注：皮下包块病理切片提示恶性肿瘤，细胞分化程度低，恶性程度 高。肿物细胞、细胞核大小形态不一，核质比显著高于正常细胞，并 出现病理核分裂相，如黑色箭头所示。A为光镜下放大100倍；B为 光镜下放大

40、400倍。 图4 肿瘤组织原代培养 Figure 4 Primary culture of tumor tissues 图注：图中A 为原代细胞爬出、生长(光镜，100)；B 为传代后肿瘤细胞生长速度出现明显提高并极易出现细胞聚团现象(光镜，200)。 图5 扩增样本的熔解曲线 Figure 5 The melting curve of sample amplification 图注：图中A为DNMT1熔解曲线，熔解温度83.5 ；B为DNMT3a熔解曲线，熔解温度85.2 ；C为DNMT3b 熔解曲线，熔解温度为 85 ；D为内参GAPDH熔解曲线，熔解温度为87 。 DNMT1相对定量 D

41、NMT3a相对定量 6 4 2 C D A B DNMT3b相对定量 人脐带间充 质干细胞 恶性转化 细胞 4 3 2 1 0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 人脐带间充 质干细胞 恶性转化 细胞 0 人脐带间充 质干细胞 恶性转化 细胞 图6 荧光定量PCR检测结果 Quantitative real-time PCR detection results Figure 6 图注：实验组(恶性转化细胞)DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA表达量较对照组(经二甲基亚砜培养的人脐带间充质干细胞)均明显升高。 3324 P.O. Box 10002, Shenyang 110

42、180 www.CRTER.org 陈业增，等. 荧光定量PCR检测恶性转化人脐带间充质干细胞中DNA甲基化转移酶的改变 www.CRTER.org 致谢：感谢汕头大学医学院第二附属医院转化医学中心及汕头大学医学院生殖医学研究中心提供的支持。 作者贡献：陈业增进行荧光定量RT-PCR检测及后期论文撰写，赖秀蓝进行人脐带间充质干细胞培养，唐秋灵、陈秋蓉进行细胞恶性诱导，邱晓燕进行裸鼠成瘤实验，郑泽鑫进行病理学检测，李伟中进行课题指导。 利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。 伦理问题：研究用人体组织和动物组织的实验方案符合相关伦理学要求，文章的撰写与编辑修改后文章遵守了国际医学期刊编辑委

43、员会学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范。 文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。 文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。 作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。 文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。 开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人

44、以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。 4 参考文献 References 1 Fu YS, Cheng YC, Lin MY, et al. Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Whartons jelly to dopaminergic neurons in vitro: potential therapeutic application for Parkinsonism. St

45、em Cells. 2006;24(1):115-124. 2 Jo CH, Kim OS, Park EY, et al. Fetal mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord sustain primitive characteristics during extensive expansion. Cell Tissue Res. 2008;334(3):423-433. 3 Ma L, Feng XY, Cui BL, et al. Human umbilical cord Whartons Jelly-derive

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47、s. 2006;24(3):781-792. 5 Fu YS, Cheng YC, Lin MY, et al. Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Whartons jelly to dopaminergic neurons in vitro: potential therapeutic application for Parkinsonism. Stem Cells. 2006;24(1): 115-124. 6 Ding DC, Shyu WC, Chiang MF, et al. Enhancement of neuroplasticity through upregulation of beta1-integrin in human umbilical cord-derived stromal cell implanted stroke model. Neurobiol Dis