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1、1,生 物 化 学 实 验,商丘职业技术学院教务处,2,1教学目的 掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能； 掌握分光光度计的使用、离心技术、电泳、层析等的原理和操作技能； 掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法； 培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。,第一节 生 物 化 学 实 验 绪 论,3,2 通过生物化学实验主要做到,学习设计或验证一个试(实)验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。 学会准确翔实地记录实验现象和
2、数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够科学、规范、清洁、整齐地进行所有的实验。 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技能，为今后参加科研及技术工作打下坚实的基础。,4,3 实验记录,实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据。 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂家等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。,5,1)生物化学实验不同于化学和生物学实验，而有其独特的实验技能和基本操作。课前必须认
3、真预习，明确实验目的、原理、操作关键步骤及注意事项。 2)要十分注意实验安全，未经实验指导老师允许不得开、关任何电源和仪器设备开关（按钮）。 3)实验时应本着认真、积极的态度，在教师的指导下完成每次实验。注意观察实验过程中出现的现象和结果，并对实验结果展开讨论。结果不良时，必须重做。 4)实验中，听从老师指导，严格遵守操作规程，取用试剂时，应仔细辨明标签，以免取错。取完试剂后，应及时将瓶盖盖好，放回原处，切忌乱拿乱放，“张冠李戴”。并应及时将实验结果和原始数据如实记录在实验报告上，按时写出实验报告。 5)实验后，必须把仪器洗净放入仪器柜内；清扫实验台面、地面；试剂瓶要摆放整齐。要经常保持实验室
4、内清洁，不乱丢纸屑及所有固体废弃物。 6)自觉遵守课堂纪律，不迟到早退；保持室内安静；不高声谈笑。同学间应互助友爱。,4 实验室规则,6,7)爱护实验器材，非本次实验使用的仪器设备未经老师允许不得乱动。本次实验必须使用的仪器设备，在了解仪器性能和操作规程之前，不得冒然使用，更不可擅自拆卸或将部件带出室外。实验过程中，如发现设备损坏或运转异常，应立即报告老师。 8)实验室内严禁饮、食及吸烟!对腐蚀性或易燃性试剂，操作时要格外小心。如酒精、乙醚等低沸点有机溶剂，使用时应禁明火，远离火源，若需加热要用水浴加热，不可直接在火上加热。用吸量管吸取试剂时应使用吸球，严禁用嘴吸取。对于有毒、腐蚀的试剂更应注
5、意，应避免其直接接触人体及衣物。乙醚、丙酮等易燃试剂应远离火源，以免发生意外。 9)注意实验室卫生、整洁。废弃液体应倒入水槽，放水冲走，有毒废弃物应放入废物缸并及时作无害化处理,实验用过的棉花、废纸、沉淀废渣及其他废弃物品等均应放入指定容器，不得随意乱扔或丢进水槽。 10)每次实验课由学生轮流值日。值日生要负责打扫实验室的卫生，整理实验室。检查水、电，关好门窗，经老师检查后，方可离开实验室。,4 实验室规则,7,5 实验须知,实验前应作好预习，认真阅读实验指导。明确实验目标，能简述实验内容及主要的操作步骤。 实验过程中，应根据实验指导及老师的要求，认真操作，细心观察，如实记录。严禁捏造实验数据
6、，提倡实事求是的科学态度，实验做错应要求重做，反对弄虚作假。 实验结束后，要认真书写实验报告，及时交老师批阅。,8,6 实验报告,实验报告包括如下内容： 实验项目(实验题目）; 实验目的; 实验原理; 实验器材; 主要操作步骤; 实验结果; 问题分析与讨论等。,9,第二节 紫外-可见分光光度计的使用原理和方法,紫外-可见吸收光谱 朗伯-比耳定律 紫外-可见分光光度计 分析条件的选择 测定方法,10,目视比色法回顾,比较溶液颜色深浅，从而确定被测定组分含量的方法，称为目视比色法。 目视比色法的准确度和精密度受视力条件影响很大，一般相对误差约在520的范围。,11,常用的目视比色法,最常用的目视比
7、色法是标准系列法: 取一套比色管，于各管中分别加入一系列不同体积的标准溶液，在测定条件下进行显色定容。此时一系列标准溶液的管中显出由浅到深的色阶。 被测溶液在同一条件下显色: 将被测溶液管与标准系列进行比较，若与其中某一管颜色相同可认为被测溶液浓度与此管浓度相等，若被测溶液颜色介于两标准颜色之间，可认为被测溶液浓度等于两管浓度的平均值。,12,常用的目视比色法,特点,利用自然光,比较吸收光的互补色光,准确度低（半定量）,不可分辨多组分,方法简便，灵敏度高,13,1)紫外-可见分光光度法(UV-VIS),按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。,
8、它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。,2.1紫外-可见吸收光谱,14,紫外光：远紫外光（10-200 nm）和近紫外光（200-400 nm）的电磁辐射。 可见光：400-800 nm的电磁辐射。溶液中物质选择性的吸收可见光中某种颜色的光，溶液就会呈现出一定的颜色。 比色分析法：比较有色物质溶液颜色深浅来确定物质含量的方法。 分光光度法：使用分光光度计进行吸收光谱分析的方法。,15,2)紫外-可见分光光度法的特点：,(1 ) 与其它光谱分析方法相比，其仪器设备 和操作都
9、比较简单，费用少，分析速度快;,(2) 灵敏度高;,(3 ) 选择性好;,(4 ) 精密度和准确度较高;,(5) 用途广泛。,16,3) 紫外-可见吸收光谱,物质对光的选择性吸收,物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础。,17,通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。 在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长max进行物质含量的测定。,18,吸收光谱（吸收曲线）： 不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同 以A作图 吸收光谱特征：定性依据 吸收峰max 吸收谷min
10、 肩峰sh,19,图示,20,吸收曲线的讨论： （1）一种吸光物质对不同波长的光吸收程度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max 。 吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。 （2）同一种物质浓度不同，其吸收曲线形状相似max不变。 在max处，吸光度A正比于浓度C 测定最灵敏 （3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。,21,4) 影响紫外-可见吸收光谱的因素,物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等可能发生变化。 温度 在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。,22,溶剂 注意
11、如下几点： （1）尽量选用低极性溶剂； （2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性； （3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。,23,5 )紫外-可见吸收光谱的应用,紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定。,24,2.2 朗伯-比尔定律,设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia ，透射光强度为 It，则 I0= Ia+ It,吸光度和透光度,25,溶液的吸光定律,透光率 （透射比）Transmittance,透光率定义：,T 取值为0.0 % 100.0 %,全部吸收,T = 0.0 %,全部透射,T = 100.0 %,26,
12、吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示A=lg1/T=-lgT=lgI0/It,透光度：透光度为透过光的强度It与入射光强度I0之比，用T表示： 即 T= It/I0,27,朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即 A= kc l 式中比例常数k(吸光系数)与吸光物质的本性、入射光波长(单色光纯度)及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。,朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。,28,偏离朗伯-比耳定律的因素,（1）入射光为非单色光,（3）光程的不一致性。 光源不是点光源，比色皿光径长
13、度不一致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。,（2）溶液的不均性。 实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可使吸光质点的吸光特性变化大。,29,2.3 紫外-可见分光光度计,基本结构: 光源单色器吸收池检测器信号显示系统, 样品,30,光源,单色器,吸收池,检测器,信号显示系统,组 成 部件,31,32,主要部件,33,光源： 用于提供足够强度和稳定的连续光谱。分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。 热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯,钨灯和碘钨灯可使用的范围在350 2500 nm； 气体放电光源用于
14、紫外光区，如氢灯和氘灯。,它们可在180 400 nm范围内产生连续光源。 在紫外光区只能用石英比色皿。紫外可见分光光度计通常都配有可见和紫外两种光源。,34,光源：提供符合要求的入射光。 要求：在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱， 具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。,紫外光源-氘灯(180-400 nm) (气体放电光源),可见光源-钨灯(350-2500nm) (热辐射光源),光 源,35,36,单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。,2 单色器,单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。 单色器的作用从波长范围较宽
15、的入射光线中，过滤分出波段较窄的单色光,37,吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。,3 吸收池,吸收池的种类很多，其光径可在0.110cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。,玻璃能吸收UV光，仅适用于可见光区 石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区 要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）,38,4 检测器 检测器的作用是检测光信号，将光信号转变为电信号并予以放大。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。,5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。,39,比色法的定量方法
16、： 标准曲线法: 将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度(A)，以A为纵坐标，浓度为横坐标制标准曲线(至少要5点)。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度,（一）单组分的定量方法,A= Kc l,40,续前,标准曲线法,41,AX,CX,A（吸光度）,C（浓度）,42,实验室常用的水: 自来水 去离子水不是没有离子的水，而是经过离子交换得到的没有干扰离子，PH值中性的水，干扰离子一般指钙、镁、碳酸根、硫酸根等，但是去离子水一般含有的有机物质是不能去除的。 蒸馏水是经过多次蒸馏得到的，有一次、二次之分，一般的有机杂质可以去除，但是无机离子还是存在。,还原糖与DNS 反应产生棕红色物质, 加入足够量的酒石酸钾钠是为了消除溶解氧的影响, 添加苯酚可增加试剂的显色作用, 添加亚硫酸钠可进一步增强试剂的稳定性.,