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1、正交实验优化甲氨蝶呤囊泡的制备* 张波1 王启平2 王慧云3全先高3 王盈盈1王宁1 （1济宁医学院基础学院，山东 济宁 272067； 2济宁任城区卫生监督所，山东 济宁 272100；3济宁医学院药学院，山东 日照 276826 ） 摘要 目的:制备甲氨蝶呤囊泡并通过正交实验优化甲氨蝶呤囊泡的制备工艺，探索最适宜的药物包封条件。方法:采用L9(34)正交法优化甲氨蝶呤囊泡对药物包封率的影响因素，以囊泡包封率为考察指标，确定最佳制备工艺条件。结果: Span40与胆固醇形成的囊泡(VSpan40 VCHOL = 42) ，在50超声40 min的条件下，对0. 60 g/L的甲氨蝶呤包封率最
2、高，可达60%以上。结论：通过正交实验优化制得的甲氨蝶呤囊泡可获得较高的包封率。关键词； 甲氨蝶呤 囊泡 包封率 正交实验 中图分类号：R943*山东省济宁市科技局课题资助项目（No：2009-19）Preparation of methotrexate niosomes and using the orthogonal test optimization ZHANG Bo, WANG Qi-ping, WANG Hui-yun,et al(Academy of Basic Medicine,Jining Medical University,Jining272067,China)Abstra
3、ct: Objective Preparation of methotrexate niosomes and thepreparation processof the methotrexate niosomes wereoptimized by means of orthogonalexperiment, To explore the most suitable drug coating conditions; Methods The methotrexate sealed rate affecting factors wasoptimizedby an L9(34) orthogonal t
4、est. niosomes sealed rate as evaluation index was used to determine the best preparation program. Results The results show that the entrapment efficiency of the niosomes prepared under the condition which are as follows: Span40 and cholesterol (VSpan40 : VCHOL ) is 2:1, the dosage of methotrexate, U
5、ltrasonic temperature and time are 0.60g/L , 50 and 40min is more than 60% . Conclusion The methotrexate niosomes optimized by orthogonal test has a higher sealed rate. Key words: methotrexate niosomes entrapment efficiency orthogonal test 非离子表面活性剂囊泡( noisome，以下简称囊泡) ，是由非离子表面活性剂和胆固醇构成的新型药物载体，其结构组成与脂
6、质体相似，具有单层或多层结构，而且化学性质稳定，能降低药物的毒副作用，提高药物治疗效果，是一种很有发展前途的新型给药系统1-3。甲氨蝶呤(MTX)是常见的抗肿瘤化疗药物，临床上用于治疗乳腺癌、白血病、肺癌等多种恶性肿瘤，其抗瘤谱较广，但其毒副作用较大，有严重的肝、肾损害，骨髓抑制，肠道反应等，为提高甲氨蝶呤的抗癌疗效，降低其毒副作用，国内外学者已做了许多研究工作，如制备甲氨蝶呤脂质体、磁导向甲氨蝶呤缓释药物、甲氨蝶呤淀粉纳米粒4-8等。本试验采用非离子表面活性剂和胆固醇作为包封甲氨蝶呤的膜材，选用L9(34)因素水平表，对甲氨蝶呤囊泡的制备工艺条件进行优化，确定最佳制备方案。 1 实验部分1.
7、1 仪器UV-2600紫外可见分光光度计(岛津公司) ；RE-52A A旋转蒸发仪(上海嘉鹏科技有限公司)；PHSJ-4A 酸度计(上海元析仪器有限公司 ) ； KQ-600GDV医用超声波清洗器(河南巩义予华仪器有限公司) ；透析袋(8000 14000) (北京索莱宝科技有限公司)；电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）1.2 试剂甲氨蝶呤（中国药品生物制品检定所）；司盘20、40、60、80（天津凯通化学试剂有限公司，均为分析纯）；胆固醇（天津科密欧化学试剂有限公司）；三氯甲烷（分析纯, 国药集团试剂有限公司）；无水乙醇（分析纯，国药集团试剂有限公司）；其它试剂均为分析纯。1.3 贮备液配
8、制一系列Span40浓度分别为0.10、0.12、0.14mol/L的溶液，以V(CHCl3 ) V (C2H5OH) = 41的混合溶剂配制。0.10 mol/L胆固醇溶液的配制 取9.67 g胆固醇溶于上述混合溶剂中，再加混合溶剂定容至250 ml。PBS缓冲溶液的配制 800 ml去离子水中溶解8.0 g NaCl、0. 20 g KCl、1. 44 g Na2HPO4、0. 42 g KH2 PO4 ，用NaOH溶液调pH至7. 4，再加水定容至1000 ml。1.4 实验方法1.4.1 囊泡的制备 分别取0.10mol/L Span20，Span40，Span 60，Span 80和
9、0.10mol/L胆固醇4.0m加入至100 ml圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪于4050水浴真空旋转蒸干有机溶剂，再加入5.0ml一定浓度的甲氨蝶呤溶液或5.0ml蒸馏水，超声40min ，即制得载药囊泡或空白囊泡。以Span40浓度、Span40和胆固醇的比例、药物浓度、超声时间为考察因素，每个因素各取3个水平进行优选，以包封率为指标进行试验，采用L9(3 4)正交实验设计（见表1）。表1 L9(34) 因素和水平水平A司盘40浓度（mol/L)B司盘40：胆固醇C药物浓度（g/L)D超声时间（min)10.104:10.43020.124:20.64030.144:30.8501.4.2 标准
10、曲线的建立 精密称取5.0mg甲氨蝶呤标准品溶于0.01mol/L的氢氧化钠溶液中，转置于50ml容量瓶中，用0.01mol/L的氢氧化钠溶液定溶。分别取上述溶液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml，置于50ml容量瓶中，用0.01mol/L的氢氧化钠溶液定容，得其浓度分别为4，8，12，16，20g/ml。以0.01mol/L的氢氧化钠溶液作空白对照，在303nm处测定其吸光度。（结果见图1）由图1可见，在测定浓度范围内，甲氨蝶呤溶液的浓度C (g/ml)与吸光度A之间存在良好的线性关系,其回归方程为：Y=0.05397C-0.00307，R=0.9999。图1 甲氨蝶呤标准曲线图1
11、.4.3包封率的测定 取2ml空白囊泡或载药囊泡溶液于透析袋中，在100ml pH=7.4的PBS缓冲液中透析24 h，取一定量的透析液，用紫外分光光度计测定其在303 nm处的吸光度，扣除空白囊泡的吸收，即可算得包封率4。2 结果与讨论 2.1影响甲氨蝶呤囊泡包封率的研究表面活性剂的影响分别采用Span20，Spa,40，Span60，Span80制备甲氨蝶呤囊泡，考察不同表面活性剂对包封率的影响，其结果见图2。由图2可见，由Span40和胆固醇构成的囊泡对甲氨蝶呤的包封效果较好。图2 Span种类对包封率的影响Span40浓度的影响 分别采用不同浓度的Span40溶液，考察表面活性剂浓度对
12、甲氨蝶呤囊泡包封率的影响，其结果见表2。Span40（mol/L）0.060.080.100.120.140.16包封率%57.3%62.0%68.4%70.3%67.5%64.7%表2 Span40浓度对包封率的影响由表2可知，当Span40浓度为0.12mol/L时包封率最高。原因是在制备囊泡的过程中加入胆固醇一般可提高膜的稳定性，降低药物的通透性， 提高包封率与载药量。胆固醇具有填充效应，它能填充在表面活性剂单体形成的分子空隙中，赋予双层膜一定的刚性9。胆固醇用量的影响固定Span40用量，改变胆固醇与Span40的比例来考察胆固醇用量对甲氨蝶呤囊泡包封率的影响，其结果见表3。由表3可知
13、，当Span40CHOL =42时，包封效率较高。比例继续增加，包封率反而下降，原因是胆固醇是助表面活性剂，可以增加双分子层中脂质分子排列的紧密程度，起到稳定类脂质体的作用，有利于囊泡的形成，但过多的胆固醇分子插入双层膜增加了双分子层的不对称性，使药物泄漏几率增加，包封率反而下降10。表3 胆固醇用量对包封率的影响Span40：CHOL4：04：14：24：34:44:54:6包封率48.9%52.7%67.5%64.7%60.1%59.2%53.9%药物浓度的影响改变加入甲氨蝶呤溶液的浓度，考察药物浓度对甲氨蝶呤囊泡包封率的影响，其结果见表4。表4 药物浓度对包封率的影响药物浓度(g/L)0
14、.20.40.60.81.01.21.4包封率 50.3%58.8%61.4%59.0%49.8%46.5%42.2%由表4可知，当药物浓度在0.6g/L时，药物的包封率达到最高。浓度较低时包封率随甲氨蝶呤浓度增加而上升 ，说明囊泡的包封容量是有限的。超声时间的影响固定其他制备条件，改变超声时间，考察超声时间对甲氨蝶呤包封率的影响，其结果见表5。表5 超声时间对包封率的影响时间/min102030405060包封率14.9%48.0%48.9%63.2%60.0%52.3%由表5可知，超声时间在40min时包封率较高。超声有利于药物的包封，但超声时间过长会打碎一些比较大的多室囊泡，使得包容药物
15、的体积减小，同时囊泡打碎的过程中也有一些药物释放出来，造成包封率下降。2.2 甲氨蝶呤囊泡制备最佳工艺确定 正交实验见表6，方差分析见表7。 表6 正交设计及结果NO.Span40浓度ASpan40:CHOLB药物浓度C超声时间D甲氨蝶呤包封率%1111157.452122265.3753133363.2754212361.355223161.4256231264.57313260.858321363.79332160.875K162.03359.88361.88359.917K262.42563.50062.53363.575K361.80862.88361.85062.775R0.6173
16、.6170.6833.658表7 正交实验方差分析因素偏差平方和自由度F比F临界值PSpan40浓度(mol/L)(A)0.58420.7926.940P0.05Span40:CHOL (B)22.461230.4566.940P0.05超声时间(min) (D)22.193230.0926.940PBCA，其中超声时间对甲氨蝶呤囊泡制备工艺影响最大，胆固醇用量影响较大，药物浓度和Span40浓度影响最小，由表6可见因素B(胆固醇用量)和因素D（超声时间）有显著性，因素A（Span40浓度）和因素C（药物浓度）无显著性。即囊泡制备的最佳工艺条件为A2B2C2D2,即当司盘40浓度为0.12mo
17、l/L，司盘40：CHOL为4：2，药物浓度为0.6g/L， 超声时间为40min时，药物的包封率达到最高。2.3 最佳工艺验证试验 按优选的最佳工艺进行三次平行试验，得出甲氨蝶呤囊泡的平均包封率为62.09%。3 结论以司盘类非离子表面活性剂和胆固醇为主要原料，采用薄膜分散法制备甲氨蝶呤类脂囊泡，以包封率作为考察指标，通过L9(3 4)正交实验优选了甲氨蝶呤囊泡的制备工艺条件，确定了较优处方，实验结果显示优选得到的最佳制备工艺条件是可行的，为新型药物传输系统的研究提供一定的依据，适合进一步研究。参考文献1 Lu B, Study on polymersome micelles and nio
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