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1、第十二章 酵母基因工程,1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母中存在质粒。 1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导 入另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷，标 志着酵母表达系统建立 1981 Hitzeman用酿酒酵母成功表达人IFN。 1983 我国首次用酵母菌表达HBV HBsAg基因。 1996 完成第一个真核生物-酿酒酵母全基因组测序,一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征,酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物。,二、酵母菌表达外源基因的优势：,全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传操作简便。,具有
2、真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。,大规模发酵工艺简单、成本低廉。,不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为安全的基因工程受体系统。,能将外源基因表达产物分泌至培养基中。,不足之处 产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等 幻灯片 7,解决内部降解的方法 在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物； 将培养基的pH值调成酸性，以抑制中性蛋白酶的活性； 利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。 幻灯片 5,第二节 常用酵母表达系统,一、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统,酿酒酵母中的2环状质粒：,RAF,野生型，双链、环状，6
3、kb，拷贝数50-100。,REP: 编码产物控制质粒稳定性 STB: REP结合位点,表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒含有ARS，不稳定，拷贝数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露糖，所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。,二、甲醇营养型酵母表达系统 表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一(A0 x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产 巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质,毕赤酵母表达系统的特点 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达 表达水平
4、高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。 发酵工艺成熟，易放大。 培养成本低，产物易分离。 外源蛋白基因遗传稳定。 作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。,三、裂殖酵母(Schizogenesis pombe)表达系统 外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象和活性。 研究较少。,四、酵母菌的转化方法,原生质体转化法 碱金属离子介导转化法 电击转化法,原生质体转化法,在Ca2+和PEG存在下，转化子可达原生质体总数的1-2%。,对线型和环状DNA的吸收没有特异性。,1个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，这种共转化的原生质体占转化子总数的
5、25-33%；,原生质体转化法的缺点：,转化率受原生质再生率的严重制约。,操作周期长；,2）碱金属离子介导转化法,酵母菌完整细胞经碱金属离子(如Li+)、PEG、热休克处理后，可高效吸收质粒DNA。,吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，二者相差80倍。,共转化现象极为罕见；,3）电击转化法,适用范围广。,酵母菌完整细胞或原生质体可在电击下吸收质粒DNA。,转化率高，达105/g DNA；,操作方便；,五、用于转化子筛选的标记基因,营养缺陷型互补基因 显性基因,宿主菌：氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变 如：LEU-、TRP-、HIS-、URA-,营养缺陷型互补基因,载体：携带相应的合成基因
6、如：leu1/leu2、trp1、his3/his4、ura3,选择压力：不完全培养基 如：YNB、无机盐培养基,编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白,显性标记基因,六、利用酵母菌表达外源基因的步骤 克隆重组 酶切线性 转化 筛选转化子 小规模诱导鉴定表达量 大规模培养以及制备,七、酵母表面展示系统 即把外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定）使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。 幻灯片 26,锚定区域与细胞蛋白的-端共价相连，为蛋白与细胞膜提供稳定的连接。锚定蛋白的-端包含疏水多肽，当细胞蛋白被合成，前体蛋白通过羧基末端的疏水序列锚定在内质网膜上，其余蛋白则位于内质网的内腔中。在极短的时间内，疏水序列在转酰氨基酶作用下位点裂开并同时被锚置换，然后蛋白被运输到高尔基体再通过分泌途径分泌至细胞膜外。在蛋白水解酶作用下，分泌信号序列被切除，细胞蛋白被-从细胞膜上释放以锚定形式与葡聚糖共价相连并被转运至细胞壁外。 幻灯片 24,凝集素展示表达系统,酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用 可应用于生物催化剂、细胞吸附剂、活疫苗、环境治理、蛋白质文库筛选、高亲和抗体、生物传感器、抗原抗体库构建、免疫检测及亲和纯化、癌症诊断等领域。,