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1、第四节酶固定化和酶分子的化学修饰,第一 酶固定化,一、为什么开展酶的固定化技术？,游离酶的一些不足之处： （1）酶的稳定性较差 （2）酶的一次性使用 （3）产物的分离纯化较困难,二、什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,固定化技术,水不溶性酶 （固定化酶）,固定化酶是被固定在某一有限空间内不再能自由流动而仍有催化活性的酶。,固定化酶是20世纪50年代发展起来的一项技术 1969年固定化氨基酸酸化酶在工业生产中被正式应用 1971年的第一届国际酶工程会议上，正式 采用固定化酶（immobilized enzyme）,固定化酶的优点,优点： 易于将酶与底物及产物分离，因而产物相对容易提纯； 酶
2、能够重复利用，使用效率提高，成本低； 大多数情况下可以提高酶的稳定性； 可以增加产物的收率，提高产物质量； 有利于实现管道化、连续化以及自动化操作，易于与各种分离手段联用。,固定化酶的缺点,但由于固定化酶是通过反应而被结合在载体上，固定化过程中酶的活力难免有一定损失； 而底物则要求是水溶性的，这样才能够接触酶而发生反应； 也不适宜于需要辅助因子的反应。 胞内酶必须经过酶的分离过程,二、酶的固定化方法,共价交联法,固定化酶的模式图,1.载体结合法,通常有物理吸附、离子吸附及螯合或共价结合法。 常用的载体如淀粉、谷蛋白等有机类载体，活性炭、多孔玻璃、硅胶等无机类载体，大孔型的合成树脂，陶瓷以及纤维
3、素衍生物类。阴、阳离子交换剂,2、包埋法(Entrapment),包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内，格子的结构可以防止酶渗出到周围的培养基中，而底物分子仍能渗入格子内与酶接触。 包埋类型可有：网格型、微囊型及脂质体液膜型。,3、共价交联法,共价交联法是通过双功能试剂或多功能试剂，在酶分子间或酶分子和载体间形成共价键的连接方法。 交联剂：具有两种相同或不同功能基团的试剂,各种酶固定化方法的比较,固定化酶的应用,固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有如下显著的优点： （1）酶的稳定性增加，减少温度、pH值、有机溶剂和其他外界因素对酶的活力的影响，可以较长期地保持较高的酶活
4、力。 （2）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提高酶的利用价值，降低生产成本。 （3）固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。 固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域。,第二 酶分子的改造,酶的活性中心 酶化学修饰的目的 酶化学修饰的原理 酶化学修饰的设计,酶的活性中心（active site）,一、活性中心的概念 酶的必需基团(essential group): 与酶活性有关的基团 酶的活性中心(active center): 由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.,酶分子,非必需基团,必需基团,活性中心 必需基团
5、,活性中心外 必需基团,结合基团,催化基团,非活性中心,活性中心,活性中心的重要化学基团 7种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser 某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。 赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基,二、活性中心的共性,(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 (2)活性部位是一个三维实体。 (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作 用等次级键结合。,三
6、、酶分子修饰及修饰目的 一）酶分子修饰 指通过对酶蛋白主链的剪接、切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造。 限制酶大规模应用的原因： 1)细胞外稳定性差； 2)酶活性不够高； 3)具有抗原性。,2. 改变酶特性有两种主要的方法： 1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。,二）、酶化学修饰的目的 1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。（70年代末之后） 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应
7、降低生物识别能力）。 4）产生新的催化能力。 5）允许酶在一个变化的环境中起作用 6）提高催化过程的反应效率 7）改变最适的pH值和温度,第三 酶化学修饰的原理 一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。,三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： 1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。,四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合 2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。,