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1、实 验 五链球菌及肠球菌的鉴定,目的要求：,1.掌握链球菌属及肠球菌属的分离培养与鉴定方法。 2.掌握链球菌及链球菌的菌落特点、菌体形态及染色性。,步骤与方法,1、观察菌落 将菌株接种于血琼脂平板上，35孵育18-24h后观察菌落，记录菌落大小、形态、表面、边缘、透明及颜色、有无溶血及特点。将肺炎链球菌继续孵育2-3天看菌落中心有无凹陷呈“脐状”。,链球菌的溶血性,溶血性链球菌,2、形态观察 涂片、革兰氏染色镜检，记录镜下细菌染色性、大小、形态、排列及荚膜。,肺炎链球菌 S. pneumoniae,形态与染色：G+球菌,矛头状 ,成双排列，宽端相对 ，尖端向外,有荚膜,肺炎链球菌革兰染色有荚膜
2、,肺炎链球菌荚膜染色特点,肺炎链球菌 S. pneumoniae,培养特性：营养要求高，兼性厌氧。初次分离需提供5%-10%的CO2。,18-24h后血平板上形成灰白色、圆形、针尖样的菌落。菌落周围有草绿色溶血环。,肺炎链球菌 S. pneumoniae,培养特性：培养48h后，菌落有自溶现象，菌落的中心会出现凹陷，像“肚脐”称脐状凹陷。,肺炎链球菌 S. pneumoniae,主要生化反应 optochin试验: 含5g optochin 纸片贴于 涂布有待测菌的平板上35孵育过夜，抑菌圈大于14mm即为敏感。,胆汁溶菌试验 原理：胆汁或胆盐能活化肺炎链球菌的自溶酶，促进细菌细胞膜破损或菌体
3、裂解而自溶。 方法：A、平板法：在血琼脂平板上选择出待检的草绿色溶血的菌落，观察记录菌落特点，然后于菌落上加一滴去氧胆酸钠溶液，35孵育15-30min观察结果。,B、试管法：将甲型链球菌和肺炎链球菌血清肉汤培养液1ml分别加入2支试管，再于各管中加入去氧胆酸钠溶液0.1ml，摇匀后置于37水浴30min后观察结果。 结果判断：平板法若菌落消失为阳性，不消失为阴性，试管法若液体由浑浊变透明为阳性，不透明为阴性，此试验是鉴别甲型溶血性链球菌和肺炎链球菌的重要试验，后者阳性。,痰标本肺炎链球菌革兰染色,A群(化脓性)链球菌,生物学性状,球形或椭圆形，链状排列，革兰染色阳性(G)， 无芽胞，无鞭毛，
4、透明质酸的荚膜。,1. 形态与染色,化脓性链球菌,A群(化脓性)链球菌,生物学性状,营养要求高：血平板或含血清培养基； 液体培养为沉淀生长； 血平板呈灰白色表面光滑小菌落，不同 菌株溶血不一， 多数有透明溶血环(b溶血现象)。,2. 培养特性,杆菌肽敏感试验 原理：A群化脓性链球菌对杆菌肽几乎100%敏感，而其他链球菌对杆菌肽通常耐药。 方法：挑取被检菌落，密涂于血琼脂平板上，将杆菌肽纸片（0.04U/片）贴于平板上，35孵育18-24h观察。 结果判断：出现抑菌环为敏感，推断为A群化脓性链球菌。,B,化脓性链球菌杆菌肽阳性,B群无乳链球菌,CAMP试验 原理：B群溶血性链球菌能产生CAMP因
5、子，该物质可促进金黄色葡萄球菌溶血素的活性，故在血琼脂平板上两菌交界处溶血能力增强，形成箭头状透明溶血区。 方法：在羊血琼脂平板上，用金黄色葡萄球菌划种一条横线，在将被检菌距金葡菌接种线3mm处直角接种一短线，35培养18-24h观察结果。同时设阳性对照和阴性对照。,结果报告： 在两种细菌划线的交接处出现箭头型透明溶血区为阳性，否则为阴性，此试验为B群链球菌与其他链球菌鉴别的重要试验，无乳链球菌为阳性，其他为阴性。,无乳链球菌CAMP试验阳性,CAMP阳性,马尿酸水解试验 原理：B群链球菌有马尿酸水解酶，可水解马尿酸为苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸可与FeCl3，结合形成苯甲酸铁沉淀。 方法：取待检菌
6、纯培养物接种于马尿酸钠培养基， 35培养48h，3000r/min离心30min,吸取上清液0.8ml于另一试管，加入FeCl30.2ml，立即混匀，10-15min观察结果。 结果：出现恒定沉淀物为阳性。,3、生化反应 1）触酶试验： 链球菌属为阴性。,（6）血清学试验（链球菌快速分群乳胶凝集试验） 原理：Lancefield根据链球菌细胞壁中多糖抗原的不同，将链球菌分为20多个群，对人类治病的多数为A群，偶见B、C、D、F、G群。用这6群抗原的兔免疫血清分别致敏的乳胶颗粒，与具有相应群特异性抗原的链球菌发生间接乳胶凝集反应，可在10min内对链球菌作出主要的分群鉴定。,方法：挑取菌落2-3
7、个转种于含有提取酶的试管中，使其成为乳化均匀的菌悬液，置37水浴15min。在卡片的相应区域滴加一滴A、B、C、D、F、G致敏胶乳，再加入处理后的菌悬液一滴分别与胶乳混匀，同时在卡片相应区域加一滴控制液与任意一滴致敏乳胶混匀，作为阳性对照，轻摇卡片，观察结果。,结果判断：在2-10min内发生胶乳凝集，为阳性。待检菌与哪群致敏胶乳凝集就表明该菌为相应血清群的链球菌。,Lancefield血清凝集分型,（7）胶乳凝集试验： 原理：抗链球菌溶血素“O”（ASO）高滴度的病人血清被适量的溶血素“O”中和后，失去了正常水平量的抗体，多余抗“O”抗体与ASO胶乳试剂反应，出现清晰、均匀的凝集颗粒。,方法
8、：先将病人血清5630min灭活，然后用生理盐水做1：15稀释。在反应板个空内分别滴加稀释血清、阳性和阴性对照血清1滴（50ul），再于各孔内滴加1滴溶血素“O”溶液，轻摇1min混匀，最后在各孔内分别滴加1滴ASO胶乳试剂，轻摇3min后观察结果。,结果判断：出现凝集为阳性、不凝集为阴性。ASO阳性可认为患者近期受溶血性链球菌感染过，可辅助诊断风湿热、肾小球肾炎等疾病。,肠球菌属,步骤和方法 1、菌落观察: 将菌株接种于血琼脂平板上，35孵育18-24h后观察菌落，肠球菌在血琼脂平板上呈灰白色、不透明、表面光滑的小菌落，菌落周围可出现溶血环，也可无溶血环。,2、形态观察 涂片、革兰氏染色镜检
9、，记录镜下细菌染色性、大小、形态及排列。 肠球菌形态类似链球菌，为单个、成双或短链状排列的卵圆形革兰氏阳性球菌。,3、生化反应： （1）触酶试验：肠球菌属为阴性反应。 （2）胆汁-七叶苷试验： 原理：培养基的胆汁对某些细菌有抑制作用，只有既能在胆汁中生长，又能水解七叶苷的细菌才能表现出对七叶苷的水解活性。肠球菌能在胆汁中生长，并水解七叶苷，使培养基变黑。,方法：将被检菌13个菌落接种于胆汁-七叶苷琼脂培养基，35孵育1824h。 结果：细菌生长，且培养基变黑色或棕褐色为阳性，不变色为阴性。肠球菌为阳性。,（3）65g/L NaCl生长试验： 原理：肠球菌有很强的耐盐能力，能在65g/L NaCl血清肉汤培养基中生长，而链球菌的耐盐能力较弱，在此培养基中不能生长。 方法：将待检菌接种65g/L NaCl血清肉汤中，35孵育18-24h。 结果：细菌生长且使得培养基变黄为阳性，不生长为阴性，肠球菌为阳性。,（3）PYR试验： 原理：多数肠球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR），释放出-萘基酰胺，与PYR试剂作用形成红色复合物。 方法：挑取被检菌落在含有PYR的纸片上涂擦， 35孵育5min，再于纸片上滴加PYR试剂，观察纸片颜色。 结果：约1min后纸片呈红色为阳性，不变色为阴性。肠球菌、A群链球菌和某些凝固酶阴性的葡萄球菌为阳性。,