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1、Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP)(LAMP) LAMP法为已知基因的检测提供法为已知基因的检测提供LAMP法为已知基因的检测提供法为已知基因的检测提供 “简便、快速、准确、廉价” 的基因检测方法。 “简便、快速、准确、廉价” 的基因检测方法。 利用该方法简便、廉价的特性、可将基因检测推广至尚未普及的领域与地区。 为满足基因检测或基因扩增的现场（例如病房临床现场检测）快速（30分钟以内）获 得结果的需求，我们提供了一种简便、准确的基因检测扩增技术。得结果的需求，我们提供了种简便、准确的基因检测扩增技术。 什么是什么是LAMP法？法？ LA
2、MP法法 LAMP法是“Loop-Mediated Isothermal Amplification”的简称、是荣研化 学独立研发可取代PCR的一种“简便、快速、准确、廉价”的基因扩增方法。 LAMP法的特征是针对目标DNA链上的六个区段设计四个不同的引物然后再利 用链置换反应在定温度下进行反应反应只需要把基因模板引物链置换型DNA用链置换反应在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA 合成酶、基质等共同置于一定温度下（6065）、经一个步骤即可完成。扩增效率 极高，可在15分1小时内实现1091010倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需 根据扩增反应产物的有无即可对
3、靶基因序列的存在与否作出判断。 特征 特征 不需要使双链DNA先变性成单链。 扩增反应在等温下可持续进行。 扩增的效率极高。 针对六个区段使用四种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列。 仅使用一种链置换型DNA聚合酶，成本低廉。 扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。 扩增产物是在同条DNA链上互补序列周而复始形成大小不的结构。 当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。 1 引物的设计 引物的设计 首先在靶基因的3末端设定F3c、F2c、F1c三个区段，在5末端设定B1、B2、B3三 个区段。针对这六个区段我们设计了如下四个引物。 FIP F2 5
4、3 F1c F3 5 F3 3 Target DNATarget DNA 53 53 Primer F1cF2cF3cB1B2B3 F1F2F3 53 B3 Primer 3 5 3 B3 B3cB2cB1c BIP 3 B2 B1c5 1. FIP： FIP引物在3末端含有与F2c互补的F2区段，在5末端含有与F1c 相相 同序列的区段。 2. F3 Primer ： F3引物含有与目标DNA上的F3序列相同的区段。 3. BIP ： BIP引物在3末端含有与B2c互补的B2区段，在5末端含有与B1c 相同序列的区段。 4. B3 Primer ： B3引物含有与目标DNA的B3相同序列的区
5、段。 关于各引物的设计，请用 LAMP法引物设计支持软件，设计中请特别注意碱基组成、 GC含量、二次结构等问题。Tm值可用Nearest Neighbor法求得。 引物设计的要点 F2 、B2、 F3、 B3的 3 末端应极力避免AT Rich设计。 扩增领域为F2B2区段间应该在200b 以内扩增领域为F2B2区段间，应该在200bp以内。 包含F2/B2在内的环状部分的长度在4060bp范围内。 各区段的Tm值应该在6065之间。 若只是为了鉴定靶基因存在与否，F1-B1的间距可以为零。 引物应避免二次结构发生。 各引物的3端不可含有与其他引物互补的序列。 2 有关于LAMP法引物设计支持
6、程序请参照富士通株式会社的 Net Laboratory （ 反应原理 反应原理 将靶基因（例如：DNA模板）与所有反应试剂一起放入65恒温槽进行反应，即会发 生以下的过程。 1. 双链DNA在65左右时会处于动态平衡的状态。这时任何一个引物与双链DNA互补部 分进行碱基配对延伸时，另一条链就会脱落成为单链。因此、LAMP法不需要像PCR法一 样得先从双链DNA变性成单链DNA始可进行反应。扩增机制方面我们将从FIP引物与单链 的模板DNA上互补区段接合的部分开始讲解（1）。 3 5 3 5 65 F3F1F2B1cB2cB3c F3cF2cF1cB1B2B3Target DNA （ （1）
7、） 5 鎖置換型鎖置換型DNA 聚合酶聚合酶 B1F3cF2c F1c B2B3 3 5 F1c F2 3 FIP 2.通过链置换型DNA聚合酶的作用，以FIP引物的3末端为起点，与模板DNA链互补 的DNA链就形成了（2）。 （ （2） ）53F3cF2cF1cB1B2B3 5 F1B1cB2cB3cF2 3 3. F3引物再从FIP引物的外侧与F3c区段接合，以F3引物的3末端为起点，通过链置换 型DNA聚合酶的作用一边将刚才从FIP引物合成的DNA链剥离，一边合成新的DNA链 (3)。 F1c F1B1cB2cB3cF2 4 F3引物通过链置换反应与碱基配对延伸形成了与目标DNA互补的双
8、链（4）。 （ （3） ） 5 3 3F3cB1F2cF1cB2B3 5 F1c F2B1cB2cB3cF1F3 Primer 4. F3引物通过链置换反应与碱基配对延伸形成了与目标DNA互补的双链（4）。 F3cB1F2cF1cB2B3 5 F3F1F2B1cB2cB3c 5 3 3（ （4） ） 3 5. 刚才被F3引物合成的DNA所剥离的单链（5）由于在5末端含有互补的F1c与F1区 段，所以通过自我碱基配对而形成环状结构（6）。 6. BIP引物与上述的DNA链（6）结合进行碱基配对，以BIP引物的3末端为起点合 成互补的DNA链并在过程中将循环结构剥离延伸成直线结构。接着B3引物从B
9、IP引物 （ （5） ） 5 3F2F1cB1cB2cB3cF1 的外侧插入进行碱基配对，以3末端为起点，通过链置换型DNA聚合酶的作用，一 边剥离先前合成的BIP引物DNA链，一边持续DNA合成。 （ （6） ） F1 B1cB2cB3c 3 7. (6)的单链通过链置换DNA聚合酶的作用则形成下图的双链（7）。 B1c F2 F1c 5 B2 5 B3 Primer BIP （ （7） ） F1cB1cF2F1B2cB3c53 F1B1F2cF1cB2B3 35 8. 另外由 (6)中被剥离的单链因为在3末端含有互补的F1c与F1区段，5末端含有 互补互的B1与B1c区段，所以整条链会形成
10、如同哑铃状的结构。而这个结构，就是我们 LAMP法的扩增循环的起始结构（8）。以上为LAMP法扩增循环起始结构的形成过程。 F1 （ （8） ） F1c B1 B2 B1cF1 F2c 5 3 （ （ ） ） 4 原理 原理（2） 9. 首先在 (8)的结构中，以3末端的F1区段为起点，以自身为模板进行DNA合成延伸。 此时5末端的环状结构被剥离延伸。因为3末端环状的F2c区段处于单链状态，FIP引 物可以与之进行碱基配对，并以F2的3末端为起点，一边剥离以F1为起点先合成的物以与行碱对并以的末端为起点剥离以为起点先成的 DNA链，一边进行DNA合成延伸。 10. 接着在 (8)中，由F1延伸
11、而得的DNA链被FIP引物延伸而得的DNA链剥离成单链， 因为在3末端存在互补区段，从而形成环状结构，并在环状结构的B1区段的3末端开 始进行以自身单链为模板的DNA合成（9）。然后这条DNA一边剥离双链部分中FIP引物 延伸得到的DNA链，一边继续延伸，形成(10)的结构。 11. 通过上述过程，FIP引物延伸而得的DNA链被剥离，成为单链，而其两端分别存在互通过上述过程，引物延伸而得的链被剥离，成为单链，而其两端分别存在互 补的区段F1、F1c与B1c、B1，经由自我碱基配对形成哑铃状结构。可以看出 (11)就是 (8)的对应结构。 12. (11)的结构和(8)的结构相同，以B1区段的3
12、末端为起点，以自身为模板进行DNA 合成，另外，BIP引物在单链的B2c区段进行碱基配对，一边剥离B1区段延伸而得的 DNA链，以便进行DNA合成延伸。由此经过与 (8)至(11)相同的过程，又再生成 (8)的结 构。 13.同时，在 (10)的结构中，BIP引物一边对单链的B2c区段进行碱基配对并剥离双链部 分，一边进行DNA链的合成。通过此过程，结果在同一根链上互补序列周而复始形成大 小不一的结构。 （ （8） ） F1c F1c F1c F1c F1c F1 F1 F1 F1c F1 F2 F2 F2 F2c F2c F2c B1 B1 B1 B1c B1c B1cB2 B2 B2c F
13、IPFIP ( (9) ) F1c F1c F1c F1c F1c F1 F1 F1c F1 F1 F2 F2 F2c F2c B1 B1 B1 B1 B1c B1c B1c B1c B2 B2 F2c F1B1B1cB2c B2c B2c ( (11) ( ) (10) ) F1cF1c 1 F1 F1 F1 F2 F2 F2c B1 B1 B1 B1 B1c B1c B1c B1c B1c B1c B2 B2 B2 B2c B2c B2c BIP F1c B1 B1c BIP 5 LAMP法的操作步骤法的操作步骤-标准法标准法- 使用试剂 使用试剂 DNA的扩增：需要使用以下试剂： 4种不
14、同的引物 （FIP、F3引物、BIP、B3引物） 链置换型DNA聚合酶 基质（脱氧核苷三磷酸）基质（脱氧核苷三磷酸） 反应缓冲液 RNA的扩增：只需在DNA的扩增试剂的基础上添加逆转录酶。 LAMP法的操作法的操作 操作简便，只需把样本（含有靶基因）与上述试剂混合在65保温小时就可以检 测扩增产物或者判定扩增与否。 靶基因（DNA 或 RNA模板） 引物（FIP, F3, BIP, B3） 链置换型DNA聚合酶 (DNA Pol mee) 检测结果 (DNA Polymerase) dNTPs 反应缓冲液 逆转录酶 （模板为RNA时） 65 15分钟1小时 就这样，LAMP法不需要改变温度，只
15、需把试剂都加入反应试管中，包括变性步骤的就这样，LAMP法不需要改变温度，只需把试剂都加入反应试管中，包括变性步骤的 全过程能在等温条件下短时间内完成，可以检测扩增产物或者判定扩增与否。 因此 LAMP法是简便简便、快速快速的基因扩增法。 并且LAMP法通过4种引物识别个区段，只针对靶基因进行扩增，是准确准确的基因扩 增法。 另外，由于LAMP法具有以下特点：1) 不需要特殊试剂、 2) 扩增不需要改变反应 温度因此不需特别的温控设备3)根据扩增的有无就能测定靶基因是否存在只需温度，因此不需特别的温控设备、3)根据扩增的有无就能测定靶基因是否存在，只需 要简单的检测仪器、所以成为了总成本低廉低
16、廉的基因检测手段。 LAMP法为简便的基因检测法，可进行实时检测。使用了环引物后，扩增时间更可 缩短为原来的1/2到1/3（快速法（后述）。 6 LAMP法的高灵敏度、简便检测、时间缩短法的高灵敏度、简便检测、时间缩短 DNA的扩增实例（的扩增实例（HBV） 检测灵敏度 检测灵敏度 HBV的扩增试验，经过65小时 扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳（浓 度2），结果表明模板浓度在6拷贝 以上时有基因扩增反应发生。因为在 LAMP法中靶基因互补序列周而复始循 环形成大小不同的结构，所以会呈现 出照片中所示的电泳图像出照片中所示的电泳图像。 用限制性内切酶Ear I 去消化扩增产 物，就会形成集中条带。
17、再对这一条 带进行测序，结果证明它们全部都是 靶基因序列。 RNA的扩增实例（的扩增实例（PSA mRNA） PSA表达mRNA扩增试验，左图是 把经过65小时扩增的产物进行琼脂 糖凝胶电泳（浓度2）的结果。在 100万个PSA非表达的K562细胞中混 在的1个及10个PSA表达细胞（LNCaP）在的1个及10个PSA表达细胞（LNCaP） 的mRNA发生了扩增。 与HBV的情况一样，用限制性内切 酶Sau3A I去消化扩增产物，就会形成 集中条带。 7 验证简便 验证简便 应用浊度的简便验证应用浊度的简便验证 扩增反应会产生一种叫焦磷酸镁的衍 生物。此衍生物与生成的扩增产物成正 比由于LAM
18、P法能产生大量的扩增产物比。由于LAMP法能产生大量的扩增产物， 衍生物的产量也会大增，于是呈现出如 左图所见的白色浑浊。因此，通过看白 色浑浊的有无，可验证是否有靶基因的 存在。 白色浑浊形成的原理白色浑浊形成的原理白色浑浊形成的原理白色浑浊形成的原理 DNA的复制过程中当一个dNTP分子结合到DNA链上的同时会解离下一个焦磷DNA的复制过程中，当一个dNTP分子结合到DNA链上的同时会解离下一个焦磷 酸根离子（PPi），PPi与反应液中的镁离子结合生产白色沉淀Mg2P2O7。在LAMP 反应中，由于DNA产物量巨大，随之而来的副产物Mg2P2O7量很大，因此通过肉眼 观察白色浑浊就可以判定
19、结果。 8 应用荧光目视试剂的简便验证应用荧光目视试剂的简便验证 钙黄绿素（鳌合剂）与试剂中的锰离子结合处于淬火状态钙黄绿素（鳌合剂）与试剂中的锰离子结合处于淬火状态。 扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发 出黄绿色荧光 荧光目视检测的原理荧光目视检测的原理荧光目视检测的原理荧光目视检测的原理 扩增反应扩增反应 DNA 聚合酶聚合酶 2 2 结合力结合力 鈣黃綠素鈣黃綠素 结合力结合力 鈣黃綠素鈣黃綠素 MnMn2+ 2+ P P2 2O O7 74 4- - dNTPs 焦磷酸锰 （白色沉淀） 焦磷酸锰 （白色沉淀） MnMn2+ 2+ Mg2+ 焦磷酸镁 （
20、白色沉淀） 焦磷酸镁 （白色沉淀） + 荧光目视检测的结果荧光目视检测的结果荧光目视检测的结果荧光目视检测的结果 Templatep (SARS-CoV) 注：黄绿色荧光的生成与LAMP反应中产生大量PPi有关，如将本试剂用于PCR 反应中，肉眼观察不到颜色的变化。 实时检测 实时检测 0.3 0.4 应用浑浊度的实时检测应用浑浊度的实时检测 0 0.1 0.2 0246810 12 14 16 18 20 22 24 26 28 浑浊度 如左图所见，白色浑浊物 （焦磷酸镁）可用吸光光度计 对浑浊度进行测定。 Template:PSA -0.1 0246810 12 14 16 18 20 2
21、2 24 26 28 时间（分钟） 以上结果为使用快速法的实验数据（后述） Template:PSA 用实时浑浊仪检测灵敏度试验结果用实时浑浊仪检测灵敏度试验结果 9 环引物的原理环引物的原理 应用环引物（ 应用环引物（Loop Primer）缩短扩增时间（快速法）缩短扩增时间（快速法） 环引物的原理环引物的原理 在LAMP法的基础上，在哑铃状结构的 5末端的环状单链部分（B1区段与B2区 段之间，或者F1区段与F2区段之间）导 入具有互补序列的环引物（分别为环引 B1 B2 B1cF1 F2cF1c 3 5 F2 F1c Loop Primer B 入具有互补序列的环引物（分别为环引 物B和
22、环引物F），就能够增加DNA合成 的起点。 例如左图中具有6个环状结构的扩增产 物，按照原本的LAMP法，其中的4个环 状结构未曾被利用作扩增起点。通过应 用环引物，所有含环状结构的单链都能 B1 B2c B1c F1 F2 F1c 3 5B2 B1c Loop Primer F BIP Loop Primer F 用作扩增起点。 BIP B2 B2c B2 F2 Loop Primer F FIP Loop Primer B Loop Primer B Loop Primer F F2c F2 标准法与快速法的比较标准法与快速法的比较 Loop Primer F F2c 通过对传统的LAMP
23、法（即LAMP标 准法）与LAMP快速法（使用环引物的 LAMP法）两者扩增时间的比较，结果 证明LAMP快速法的扩增时间是LAMP 标准法的1/1/，30分钟以内就 能扩增1091010倍能扩增10 10倍。 10 利用LAMP法的利用LAMP法的单核苷酸(SNPs)多态性分型单核苷酸(SNPs)多态性分型 基于LAMP法的SNPs多态性分型，是利用LAMP法的高特异性特征，在具有相似碱 基序列的不同基因中选择性地仅针对靶基因进行扩增。而且根据扩增反应的特性（请 参照反应原理部分），每次基因复制时都会对DNA双链的正反两个方向的SNP位点进 行校正，能够严格区分单一碱基的差异，从而简单地通过
24、扩增反应的有无一个步骤进 行SNPs多态性分型。 进一步结合LAMP法简便快速的特性可以在30分钟以内简单地完成检测进步结合LAMP法简便、快速的特性，可以在30分钟以内简单地完成检测。 针对靶基因上的6个区段设计的4个不同的引物，能够保证在相似基因序列存在情 况下也只有靶基因序列得到特异性扩增。 具有能够严格区分单一碱基差别的反应特性。 特征 特征 扩增反应的有无（一步工艺）进行SNPs多态性分型 11 SNPs 多态性分型的原理多态性分型的原理 下图以使用野生型（WT) 引物的场合为例进行原理说明。 首先，在FIP及BIP的设计时，在其5末端引入SNP碱基（此处为野生型等位基因）。 通过使
25、用这WT引物如果靶基因为野生型等位基因时由LAMP法的起始哑铃状结构通过使用这一WT引物，如果靶基因为野生型等位基因时，由LAMP法的起始哑铃状结构 引发DNA合成反应，扩增反应持续进行。相反，如果靶基因为变异型等位基因，由哑铃状 结构不能引发DNA合成反应，扩增反应不能进行。万一发生错误，合成反应被引发，也会 因为在反应过程中反复在同一变异位点接受校正，扩增反应会停止或被延缓。 MUT allele MUT allele WT allele WT allele 3?5? F3 F3cF2cF1c B1B2B3 3?5? C SNP 3? 5? F2 F1c C FIP Primer F3 P
26、rimer 3?5? F3 F3cF2cF1c B1B2B3 3?5?T SNP 3? 5? F2 F1c C FIP Primer F3 Primer 3?5? B3 F2F1 B1cB2cB3cF3 3? 5?3? 5? C G 3? 5? B2B1c G G C G F1 3? B1c B2 F1 F2c F1c 5?B1c BIP Primer B3 Primer B1 3?5? B3 F2F1 B1cB2cB3cF3 3? 5?3? 5?T A 3? 5? B2B1c G G T G F1 3? B1c B2 F1 F2c F1c 5?B1c BIP Primer B3 Primer
27、 B1 扩增检测扩增检测不扩增不扩增 B1 B2c F2 F1c 5? G C C 3? B1 B2c F2 F1c 5? A C C 3? SNPs多态性分型的步骤多态性分型的步骤 基因组 DNA和LAMP法的试剂及荧光显色剂一起，在一定温度（60）保温一定时间，通 过扩增反应的有无就能进行SNPs多态性分型。 基因组 DNA 引物 （WT or MUT） 链置换型DNA聚合酶 dNTPs 反应缓冲液 判断结果 密闭体系60反应 反应缓冲液 荧光显色剂 密闭体系60反应 （30分钟） 12 利用人类基因组样本的 利用人类基因组样本的SNPs多态性分型多态性分型 CYP2C19基因及其家族基因
28、及其家族 以药物代谢相关基因CYP2C19为靶 基因进行SNP多态性分型时，如左图 所示，必须在众多的相似序列中能够 辨别出1个碱基的差异，使得只有 CYP2C19基因发生特异性地扩增。 这个多态性分型的例对这个SNP多态性分型的例子，对于 普通2种引物和探针组成的反应体系很 难实现。因此需要像LAMP法所具有的 针对6个区段设计的4条引物这样的高 特异性保证。 利用人类基因组样本进行利用人类基因组样本进行CYP2C19 基因的基因的SNP多态性分型多态性分型 利用人类基因组样本，用LAMP法对CYP2C19基因进行的SNP多态性分型的结 果如上图所示。纯野生型的样本（wt/wt）只有在WT引
29、物存在下会发生基因扩增。 纯变异型的样本（m1/m1）则只有在变异型（MUT）引物存在下发生了基因扩增。 野生型和变异型的杂交样本（wt/m1）则是在WT引物和MUT引物存在下都发生了 扩增反应。 13 利用血液样本的 利用血液样本的SNP多态性分型多态性分型 经确认， LAMP法只需要对血液样本进行热处理、无需核酸抽取操作，就可用和 基因组DNA样本完全相同的方法来进行多态性分型。即，将血液在95进行热处理 后与试剂（引物DNA聚合酶dNTPs荧光显色剂反应缓冲液等）混合在60 与与PCR-RFLP法的比较法的比较 后，与试剂（引物、DNA聚合酶、dNTPs、荧光显色剂、反应缓冲液等）混合在
30、60 进行反应。反应开始30分钟后，仅通过确认荧光强度即可进行SNPs多态性分型。 对86份人类血液样本进行的 CYP2C19基因SNP多态性分型的结果 如左图。与传统的PCR-RFLP法界进 行了比较，结果完全一致，并且测 序的结果也一致。 LAMPwt/wtwt/m1wt/m2 m1/m1 m1/m2 m2/m2 wt/wt3000000 wt/m10250000 t/ 20014000 PCR-RFLP 作为传统法的PCR-RFLP法需经过 3个步骤约5个小时。然而，利用 LAMP法进行CYP2C19基因的SNP多态 性分型只需一个步骤，30分钟以内 即可出结果。 wt/m2001400
31、0 m1/m1000900 m1/m2000060 m2/m2000002 n=86(人类基因样本) 通过目测进行 通过目测进行SNP多态性分型多态性分型 利用野生型引物和荧光显色剂(溴乙锭)进 行LAMP反应后，在紫外灯下，可以确认只 有野生型基因发生了扩增。 14 LAMP法的实验室常规操作步骤及试剂法的实验室常规操作步骤及试剂 LAMP反应所需的试剂反应所需的试剂 LAMP法实验室操作步骤法实验室操作步骤 基于 基于LAMP法的临床诊断试剂特点及实例介绍法的临床诊断试剂特点及实例介绍 LAMP法临床诊断试剂特点法临床诊断试剂特点LAMP法临床诊断试剂特点法临床诊断试剂特点 ?前处理简易
32、核酸提取简单化。如LAMP法流感试剂检测试剂盒仅需把采取到样本的棉签放在裂解 试剂中搅拌即可完成抽取步骤。 ? 常温保存 干燥剂型产品，实现了试剂调配过程的简单化；并且使试剂的常温保存成为可能（区别 于传统冷冻保存）。 ? 便于结果判断 不仅仅通过实时浊度，荧光目视法也能进行结果判断。 。 LAMP法流感检测试剂操作简介法流感检测试剂操作简介 DNA 扩增试剂 DNA 扩增试剂 利用利用LAMP法的新产品法的新产品 RNA扩增试剂扩增试剂 可对任意标的DNA进行扩增的简易试剂盒（不可对任意标的RNA进行扩增的简易试剂盒（不可对任意标的DNA进行扩增的简易试剂盒（不 含引物、模板） 可对任意标的
33、RNA进行扩增的简易试剂盒（不 含引物、模板） 荧光目视检测试剂盒 荧光目视检测试剂盒 无需特殊装置或电泳，通过目视法来进行核酸扩 增反应发生与否的判断用的试剂。 实时浊度仪 实时浊度仪LA-320C 能够实时检测基因扩增反应，MBNQ法专用的 浊度测定装置。 引物设计支持软件 引物设计支持软件 针对任意选定的靶基因，自动进行引物设计， 提供5组（每组2对）适用于LAMP法的候补引物 序列。 反应试管 反应试管 用于浊度计检测扩增反应的高透明度薄管壁专 用反应试管 提供免费网上引物设计支持服务（富士通 Net Laboratory） http:/primerexplorer.jp/e/ 16 有关LAMP反应原理、产品等的详细情况，有关反应产等的详细情况 请参阅荣研公司主页： http:/loopamp.eiken.co.jp/ 或中国总代理北京蓝谱生物科技有限公司主页： pjgp 您也可以通过下述联系方式联系我们： TEL：010-82101210 FAX：010-82101211 E-Mail： 经 销 商 联 系 方 式经 销 商 联 系 方 式 2010年08月版