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1、霍乱弧菌实验室检测技术,霍乱的流行情况 霍乱的生物学性状 样本的采集 检验操作程序 荧光定量PCR方法检测O1群、 O139群霍乱弧菌及霍乱毒素,提纲,由O1群、 O139群霍乱弧菌引起的霍乱以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征，被世界卫生组织列为国境卫生检疫传染病，也是我国传染病防治法中规定强制管理的甲类传染病。,O1群霍乱弧菌的流行情况 1817年1923年发生六次霍乱的世界大流行 均由O1群霍乱弧菌古典生物型引起 1820年古典生物型引起的霍乱首次传到我国 1961年开始了第七次霍乱的世界大流行 均由O1群霍乱弧菌埃尔托生物型引起（1905年发现） 1961年埃尔托生物型霍乱
2、首次传到我国,O139群霍乱弧菌的流行情况 1992年印度马德拉斯发生O139霍乱并迅速传播 1993年6月我国新疆发现O139霍乱流行。 1994年我市发现O139霍乱疫情,O1群和O139群霍乱弧菌与其他霍乱弧菌的最大区别是能产生相同的霍乱毒素,弧菌的分类 形态与染色 抗原结构、血清群 生长与培养特性 生化反应特性 对外界的抵抗力 药物敏感性,霍乱的生物学性状,弧菌的分类（包括5个属） 弧菌属 霍乱弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌、河弧菌等等 气单胞菌属 邻单胞菌属 发光菌属 水栖菌属,霍乱的生物学性状,形态与染色 革兰氏染色阴性，两端钝圆或稍平 单鞭毛、鱼群样排列，菌体弯曲呈弧形或逗点状 暗视
3、野显微镜下，霍乱弧菌运动活泼，呈穿梭状或流星状 培养基上菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润,霍乱的生物学性状,革兰氏染色阴性，两端钝圆或稍平,单鞭毛、鱼群样排列，菌体弯曲成弧形或逗点状,抗原结构、血清群 H抗原和O抗原 根据O抗原不同，分为200多个血清型 根据O抗原成分的不同分群特异性抗原因子和型特异性抗原因子 O1群据型特异性抗原成分不同分为小川、稻叶、彦岛三个血清型 小川型含A、B抗原因子，也含少量C因子成分 稻叶型含A、 C因子 彦岛型含A、B、C因子,霍乱的生物学性状,生长与培养特性 好氧同时兼性厌氧，最适生长温度37 钠离子可刺激生长 耐碱不耐酸 初次分离时常用碱性蛋白胨
4、水(pH8.8-9.0)增菌培养， 霍乱弧菌经68h增菌后可在液体表面大量繁殖，形成菌膜,霍乱的生物学性状,生化反应特性 两个生物型的霍乱弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖 产酸不产气 迟缓发酵乳糖，不分解阿拉伯糖 氧化酶试验 弧菌属细菌大多为阳性 粘丝实验 弧菌属细菌大多为阳性,霍乱的生物学性状,对外界的抵抗力 在河、井、海水中可存活13周以上 食物和海产品上存活7天左右 对低温和碱耐受力强 （在食品上的弧菌于冰箱保存（05度）比室温存活时间长） 对热、干燥、太阳直射敏感 对含氯制剂、碘制剂敏感 对酸和强氧化剂极敏感 煮沸100度12min即可被杀死 药物敏感性 细菌带有可传递的耐药质
5、粒 近年产生多重耐药株（丁胺卡那霉素 、强力霉素、复方新诺明 ） 诺氟沙星和环丙沙星对霍乱弧菌保持较高的敏感性,霍乱的生物学性状,霍乱的致病性 主要毒素 霍乱肠毒素CT 小带联结毒素zot 辅助霍乱肠毒素ace 溶血素、溶细胞素、志贺样毒素 O139 群除具有上述 O1 群的致病物质外，还存在荚膜多糖和特殊 LPS 毒性决定簇，可抵抗血清中杀菌物质和黏附到小肠黏膜 上。,霍乱的生物学性状,腹泻患者样本采集 水样便采13ml，成形便取指甲大小量 肛拭子：生理盐水浸湿采便管由肛门插入直肠内35cm处旋转取出 呕吐物采13ml 标本和碱胨水比例为1：5 水样及液体标本采集 采集相对静止表层水（30c
6、m内）500ml 其他液体标本采集500ml 23小时内送检 涂抹样本采集 23支无菌棉签涂抹35只以上水生动物表面、腮部及泄殖腔 23支无菌棉签涂抹食品或物品表面（地沟口，下水管口，水池壁涂抹，餐盘内外侧） 直接放入10ml碱胨水送检,样本的采集,典型的米泔水样便,动力试验 水样便：取一滴在玻片上，盖盖玻片，暗视野显微镜直接观察 成形便：取适量在生理盐水中研磨，盖盖玻片，镜下观察 高度可疑样本：取增菌的碱胨水在玻片上，盖盖玻片，镜下观察 镜下有穿梭样运动为动力试验阳性 动力抑制试验 取O1群、 O139群霍乱弧菌诊断血清，取适量标本在其中研磨 穿梭样运动消失，菌体凝集成块为动力抑制试验阳性,
7、检验操作程序,增菌及分离培养 碱性蛋白胨水pH 8.8-9.0 注意标本和胨水的比例要适当 分离培养基分两类 选择性强的培养基 四号琼脂、TCBS、庆大培养基 选择性弱的培养基 碱性琼脂和碱性胆盐琼脂,检验操作程序,霍乱弧菌在庆大培养基上菌落形态。(菌落呈现无色 、圆形半透明、湿润、扁平或稍突起、边缘整齐，由于亚碲酸钾的作用，菌落中央常呈灰色或灰黑色）,型霍乱弧菌在号平板和上的菌落形态,病人粪便标本,增菌 6-8h,庆大平皿划线培养 18-24h,每皿挑取9-10个可疑菌落血清凝集试验,向医院属地CDC报告医学观察病例,霍乱分群诊断（单克隆抗体）,群,群,二次增菌6-8h,1、悬滴动力试验（+
8、），动力抑制试验（+） 2、有明确流行病学史，动力试验（+），动力 抑制试验（+）,症状典型但服药患者便,检验操作程序,菌株的初步鉴定 血清凝集试验 复核及鉴定 血清凝集试验 革兰氏染色 氧化酶试验 粘丝试验 动力试验,检验操作程序,菌株的初步鉴定 血清凝集试验 挑取可疑菌落与O1群、 O139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验，很快出现均匀沙粒样凝集颗粒为阳性（一般不超过10s） 注意：菌液浑浊，似凝非凝不能判定为阳性 同时做生理盐水对照 在1min内不出现凝集为阴性 结果可疑时需要做PCR鉴定,检验操作程序,菌株的复核及分型 血清凝集试验 用O1群、 O139群霍乱弧菌诊断血清与挑取的菌落进
9、行玻片凝集 O1群霍乱弧菌分型用小川型和稻叶型单价血清进行玻片凝集 结果分3种情况 同时做生理盐水对照,检验操作程序,菌株的复核及分型 氧化酶试验 弧菌属大部分为阳性，作为弧菌的简易辅助鉴定方法 用氧化酶试剂（1%盐酸二甲基对苯二胺）湿润滤纸 取营养琼脂上菌落涂抹于有试剂的滤纸上 反应部位在12min内出现粉红-紫红-紫蓝色判为阳性 肠杆菌科细菌不变色或变粉后很快退色 注意不使用过期试剂和金属接种针,检验操作程序,菌株的复核及分型 粘丝试验 弧菌属大部分为阳性作为弧菌的简易辅助鉴定方法 在玻璃平皿上滴一大滴0.5%去氧胆酸钠溶液 取营养琼脂上新鲜培养物研磨后与试剂研磨混合 混悬液变清亮粘稠，可
10、拉出细长丝者为阳性 阴性者呈均匀悬液状态 动力试验 革兰氏染色,检验操作程序,药敏试验 根据美国临床实验室标准委员会（NCCLS）推荐的Kirby -Bauer（K-B）氏法进行。,检验操作程序,药敏试验注意事项 每次药敏试验必须用ATCC 25922大肠杆菌做质控 使用的MH培养基不能太薄 使用的MH培养基PH值应为7.3 抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限 不可用过期的试剂和药敏纸片,检验操作程序,荧光定量PCR方法鉴定 探针和引物,检验操作程序,荧光定量PCR方法鉴定 模板的制备： 挑取数个菌落加入装有100去离子水的1.5mL 管中,混匀后100 10分钟，12000转/分钟离心5分钟，取上清液作为模板。,检验操作程序,荧光定量PCR方法鉴定 反应体系的配制(20 体系) （Pemix Ex TaqTM TaKaRa 生物公司提供） 2 PCR反应混合物： 10/份 上游引物（10M）： 0.4/份 下游引物（10M）： 0.4/份 探针（10mol/）： 0.4/份 模板DNA： 2/份 DDw： 6.8 /份 Total: 20 ,检验操作程序,荧光定量PCR方法鉴定 荧光定量PCR反应条件： 95 10s 95 5s 60 20s 结果判定：Ct值在10-30之间且有典型的“S”形曲线,检验操作程序,谢谢,