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1、 猪流行性腹泻诊断方法研究进展【摘要】猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的乳猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要特征的急性接触性肠道传染病。由于与该病类似的肠道性传染病较多，所以仅通过临床症状和病理组织学变化很难做出准确的诊断。只有借助实验室诊断技术进行鉴别诊断才能作出确诊。随着对PEDV基因组分子生物学研究的不断深入，多种分子生物学诊断技术开始出现，本文针对该病现有的分子生物学诊断方法进行了阐述。【关键词】猪流行性腹泻；分子生物学；诊断；研究进展 Advan
2、ces in diagnostic methods porcine epidemic diarrheaAbstrct Porcine epidemic diarrhea is a piglet from porcine epidemic diarrhea virus causes vomiting, diarrhea and dehydration as acute intestinal infectious contact the main feature. Because the disease is similar to intestinal infectious diseases, w
3、hich is why only through clinical symptoms and pathological changes is difficult to make an accurate diagnosis. Only by means of laboratory diagnostic techniques in order to make the differential diagnosis confirmed. With the study of genomic molecular biology PEDV deepening variety of molecular bio
4、logy diagnostic techniques began to appear, the paper for the disease existing diagnostic methods of molecular biology are described.Key words Porcine epidemic diarrhea; Molecular Biology; Diagnosis; Progress advance 前言 猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus,
5、 PEDV)引起的一种严重的病毒性传染病。该病的特征是可以导致哺乳仔猪发生严重的腹泻、呕吐、脱水，并且致死率极高1。猪流行性腹泻(PED)在1971年在英国首次被报道，之后1978 年在日本、德国、比利时等地爆发。 在1976年，中国首次报道了该病。 在这之后的20年间，该病已经在我国的20多个省份爆发，给农民及养猪业造成了巨大的损失。在欧洲，猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的腹泻主要集中在架子猪、育肥猪及青年种猪。在我国，各年龄的猪都极易感染PEDV的猪群2。在寒冷季节，猪的病毒性腹泻主要由猪流行性腹泻病毒引起，保育与育肥猪的群的感染率较高于哺乳仔猪和母猪3。1.基因型 PEDV基因组是单股
6、正链RNA，与其他的冠状病毒具有相似性。PEDV基因组5端有一个帽子结构(cap)，3端有一个Poly(A)尾。 现在已经测定了PEDV CV777株完整的基因组序列，大小为28 033 bp4。 目前除了人冠状病毒229E毒株(HCoV-229E)外，已知的其他冠状病毒成员都有Kozak序列，但是序列有所差异5。基因组序列包括6个ORF，从53依次为编码复制酶多聚蛋白lab、纤突蛋白、ORF3蛋白、小膜蛋白、膜糖蛋白和核衣壳蛋白的基因。在我国有不同于CV777疫苗株的新基因型的PEDV在流行，而他是否是CV777疫苗株的变异株， 还需要进一步的实验验证6。实验室诊断方法 PED在临床症状上与
7、猪传染性胃肠炎（TGE）极其相似，而通过临床症状很难鉴别出这两种病, 有时还会与猪轮状病毒共同感染。所以，通常用实验室诊断技术来检验是否是PEDV引起的腹泻。常用的实验室诊断技术有微量血清中和试验、免疫电镜法(immuno electron microscopy, IEM)、免疫荧光法(fluorescent antibody technique, FAT)、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、反转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-PCR, RT-PCR)等。下面介绍一下如今实验室经常检查的几种分子生物
8、技术：2.1 反转录-聚合酶链式反应 随着分子生物学的不断发展，关于PEDV的检测方法越来越受到广大研究学者的重视. RT-PCR技术也成为了检测PEDV的最有效的技术手段之一。国内外的研究人员已经在这方面进行了深入研究。2003年，吴凌等7利用RT-PCR扩增出854bp的PEDV M基因的全长片段, 以其为模板, 通过巢式反转录PCR(RT-nested PCR)扩增到412bp的M基因的部分片段。2010年，Ben Salem等8建立了检测猪肠道病毒的多重巢式PCR, 可以检测到PEDV的RNA浓度为27.2g/L, 证明了巢式PCR的敏感快速。2.2 荧光定量PCR 荧光定量PCR(F
9、luorescent QuantitativePCR，FQ-PCR) 技术是在普通PCR 反应体系中添加了荧光报告基因，通过描述荧光信号的积累情况使PCR 过程图像化，最后通过绘制出的标准曲线对目的片段进行量化的方法。随着PCR 反应的进行，产物不断累计，由此产生的荧光信号强度也成比例地增强。反应每进行一个循环，收集一次荧光强度信号，这样便可以通过荧光强度变化来反映产物量的变化。从而将荧光扩增曲线转换为产物增长曲线。PCR 定量的关键是如何选择指数扩增期和作为对照的内参基因。因为PCR的定量方法可以鉴定出细微的差异，所以荧光定量PCR 技术与常规的技术方法，如Southern、Northern
10、和点印迹杂交定量相比具有更高的敏感性9。该方法同样在PED 诊断方面也得到了应用。Kim 等以Taq Man 荧光定量分析技术为基础，用FAM 作为报告基团，Cy5 作淬灭基团，成功建立了多重荧光定量PCR 方法，为PEDV 和TGEV病毒定量分析提供了 可靠的技术手段，两种病毒的最低检出量分别是90 拷贝/L 及70 拷贝/L。国内学者也同样建立了PEDV 的荧光定量RT-PCR 检测方法。2010年, 刘邓等10设计了一对特异性引物和探针, 扩增长度为186 bp的片段。以克隆N基因的质粒作为阳性标准品, 建立了一种快速检测猪流行腹泻病毒含量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。2.3
11、多重RT-PCR 多重PCR 的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定。由于与PDEV 能够产生相似临床症状和病理变化的病原体较多，而如何在混合感染的样品中同时鉴定多种病原微生物显得非常重要。由于PED属于病毒性腹泻病, 而病毒性腹泻病是由猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和猪轮状病毒引起的，所以通过临床症状很难区分这3种病毒。多重RT-PCR就很好地解决了这个问题。2009年, 田小艳等11针对猪轮状病毒的VP6基因309 bp、TGEV的N基因612 bp和PEDV的N基因492 bp设计并合成了扩增引物, 建立了多重RT-PCR的检测方法。2010年, 张坤等12也建立了能同时检测PEDV(M基
12、因663 bp)、TGEV(N基因528 bp)和猪A轮状病毒(VP7基因333bp)的多重RT-PCR的检测方法。2011年, 郑新添等13建立了多重RT-PCR检测方法, 该方法针对猪轮状病毒的VP7基因412bp、TGEV的M基因252bp和PEDV的N基因540bp。2.4 RT-LAMP技术 日本科学家Notomi于2000年在Nucleic Acids Res 杂志上公开发表了一种新的用于基因诊断的等温核酸扩增技术，也就是环介导等温扩增技术英(Loop-mediated isothermalamplification)，该技术受到了世卫组织WHO、各国研究者及相关科研、政府部门的关
13、注。仅仅经过了几年，该技术已经多次应用于病毒的检测中，例如SARS、禽流感、HIV 等。而RT-LAMP则是环介导等温扩增技术的一种延伸，该方法以RT 为基础，然后再经等温的条件下进行自动循环的链置换核酸扩增反应。RT-LAMP的检测是在LAMP扩增DNA的基础上, 加入了反转录酶而实现扩增检测RNA, 反转录和扩增一步完成，省去了传统RT-PCR要先进行的反转录步骤。2011年，Ren等14建立了一种RT-LAMP，该方法一方面能从临床病料中检测PEDV或TGEV, 又能对TGEV、PRV、PRRSV及猪的伪狂犬病毒等进行鉴别诊断, 同时具有比RT-PCR技术及ELISA更高的敏感性。 同时
14、Li等15也建立了能对TGEV进行鉴别诊断的高敏感RT-LAMP，为有效检测猪病毒性腹泻提供了重要参考。3. 总结近些年来, PEDV的研究已经取得了一定的进展,特别是在PEDV的实验室诊断和疫苗研制方面，通过实验室诊断方法，及时发现PEDV的感染，做到早发现，早治疗，并通过疫苗的预防接种，可以大大减少PEDV对猪业市场的危害。由于国内混合感染情况常有发生，因此在三联疫苗的研究上还应进一步深入。相信在不久的将来能够对猪腹泻行疾病该病将有更深入的了解, 并为预防此类疾病提供更坚实的基础。 近几年来在对猪流行性腹泻的实验室诊断技术的研究中，主要应用是血清学方法和分子生物学方法，而后者以其实用性强、
15、高效、快速、准确而被广泛应用。尤其是RT-PCR 断技术，该方法比其他诊断方法更加敏感，特异性也较强。但受到仪器设备的限制，分子生物学的诊断方法目前还无法进行普及，从而导致无法应用于临床诊断。但随着分子生物学技术的不断发展，这种诊断技术在PED诊断中肯定能够得到广阔的应用。 参考文献1王靓靓,李训良,李鹏冲,任晓峰,等.猪流行性腹泻的诊断与预防J.世界华人消化杂志 2013,21(1):33-38.2甘振磊,汤德元,李春燕,王彬,张晓杰,王凤,刘志杰,等.猪流行性腹泻流行特点及流行现状的研究J. 猪业科学2010,27:24-28.3张坤.猪病毒性腹泻多重RT-PCR诊断方法的建立和应用及猪轮
16、状病的的分离J. 华中农业大学,2010.4 Kocherhans R, Bridgen A, Ackermann M, ToblerK. Completion of the porcine epidemic diarrhoeacoronavirus (PEDV) genome sequence. Virus Genes2001;23: 137-144.5 Brian DA, Baric RS. Coronavirus genome structureand replication. Curr Top Microbiol Immunol 2005; 287:1-30. 6 陈建飞,王承宝,时洪
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