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1、全基因组测序技术在预防医学中的应用综述(2)3疾病流行规律分析和预测使用群体遗传学方法，对病原体的历史分离株进行全基因组序列分析和进化研究，可以推测病原的长期流行情况，深入认识其所致疾病的流行规律。流感是最常见的呼吸道传染病，每年在全球造成几十万人死亡。通过北半球（美国纽约）和南半球（新西兰）在12年间分离的上千株甲型流感病毒的序列分析，Rambaut等22提出了流感流行的源库模型;（source-sink model）。他们推测，流感病毒的遗传多样性在位于热带地区的宿主种群中（source）持续产生，并在强烈的自然选择作用下发生抗原漂变等变异。随后，在热带地区变异后的流感病毒季节性传播到南北
2、半球的温带地区（sink）并在当地造成流行。因此，要从根源上遏制流感疫情，不仅要对流行区域进行疫苗接种等防控措施，还须要重视对热带地区流感宿主种群的研究。鼠疫菌是对人类历史影响最深远的病原之一，曾导致3次世界范围的大流行。但由于缺乏病原学证据，前2次大流行（公元6世纪的查士丁尼瘟疫和14-17 世纪的中世纪黑死病） 是否为鼠疫菌所致在学术界一直有争议。直到近年来，通过对死于前2次瘟疫的患者尸骨中提取的古DNA进行全基因组测序，才为这些争议盖棺定论23-24.分析结果显示，古DNA与现代鼠疫杆菌在核心基因组上仅存在几百个单碱基差异，证明2次流行确实是鼠疫杆菌所致。造成2次流行的鼠疫杆菌分属于不同
3、的进化分支，其中引起第1次大流行的分支已经在进化长河中消失；而引起第2次大流行的分支被保留下来，其后代在进化了几百年后又导致了第3次世界大流行24.对全球代表性鼠疫杆菌分离株的全基因组测序和分析进一步加深了我们对鼠疫流行规律的认识。研究结果表明鼠疫可能起源于中国青藏高原东部，并通过丝绸之路、茶马古道和唐蕃古道等古商贸途径传播到世界其他地区，说明人类活动在鼠疫传播中起到重要作用25-26.通过适当的数学方法对病原体基因组变异进行解析，可以推测产生变异的系统发育过程，以及进化传播过程中的各种重要参数，包括传播速度、基础复制率、采样比率、有效种群大小等。Stadler等27应用基于贝叶斯方法开发的存
4、亡轮廓线模型（birth-death skyline plot, BDSP）对HIV基因组序列进行分析，重现了由于成功应用鸡尾酒疗法，英国的B型HIV-1有效复制率和种群多样性在20世纪90年代开始呈现明显下降的趋势；并指出在90年代中期之后，由于高效抗反转录病毒疗法的产生，HIV的有效复制率开始低于1,提示流行趋势已得到控制。该方法还被应用于63株埃及分离的HCV的序列分析，结果清晰显示了20世纪初由于抗血吸虫注射疗法造成埃及HCV感染急剧增加，而在70年代之后，由于口服疗法逐渐取代了注射疗法，HCV感染率及有效种群也随之下降27.BDSP方法从数学层面将基因组序列变异和疾病流行规律结合起来
5、，在将来疾病流行趋势分析中将发挥重要作用。4疫苗变异监测和使用效果评价利用全基因组序列分析，我们还可以对疫苗株的变异及使用效果进行监测和评价。EV76是鼠疫耶尔森菌减毒活疫苗，曾在世界范围内应用于鼠疫预防接种。通过对中国保藏的EV76-CN株进行全基因组测序，并与鼠疫杆菌野生株进行比较分析，我们鉴定出疫苗株发生了12个突变（6个单核苷酸多态性和6个插入缺失）。选择更多来自不同研究所和国际保藏中心的EV76疫苗株，对这些突变位点进行了扫描，结果发现该疫苗在各个国家之间转移、运输和生产的过程中，至少已形成5个种系，并发现中国使用的EV76株存在3个独立的来源28.基因组水平的遗传变异可能导致疫苗株
6、表型变化，进而影响接种后的免疫效果，因此我们的发现将有助于阐明各批次疫苗的免疫效力不同的问题，为疫苗的质量监测提出了新的思路。美国从2000年开始，大范围应用肺炎球菌脂多糖-蛋白质联合七价疫苗（PCV7）。与此同时，能逃避疫苗的肺炎链球菌菌株在种群中的频率开始上升。2012年，Golubchik等29通过对62株19A血清型肺炎链球菌的测序分析表明，同源重组造成关键遗传片段在菌株间的水平转移，是导致疫苗逃避的最重要原因。研究还发现，在重组造成荚膜转换，从而逃避疫苗作用的同时，大量其他未知功能的基因组片段也通过搭车效应转移到受体菌中。因此，疫苗的大规模应用会对细菌种群的进化产生一些难以预料的后果
7、。2013年，Croucher等30进一步研究了肺炎链球菌种群在疫苗作用下的进化机制，通过616株无症状携带者分离的肺炎链球菌基因组序列比对，研究者在荚膜生物合成基因簇、抗原蛋白编码基因PspA和PspC等基因元件中观察到了显着的重组事件。结合近十年的流行病学资料进行综合分析发现：重组对整个种群的血清型转换和耐药谱产生了影响，受到免疫的7个血清型几乎完全消失，取而代之的是非疫苗免疫的型别。但接种疫苗前后物种的基因库基本没有发生变化，因此尽管儿童患病率显着下降，肺炎链球菌的无症状携带者比例与疫苗使用前相比无显着差别。以上研究让我们了解到大规模疫苗接种行为对病原体种群组成的影响，这为将来疫苗的针对
8、性设计提供了依据。5问题与展望尽管已经在预防医学领域取得了显着进展，但全基因组测序技术要真正进入基层疾病监测机构和医院，仍然有很长一段路要走。首先要解决的是成本问题。目前上市的测序仪主要为人类基因组研究设计，而普通细菌基因组大小仅为人类基因组大小的千分之一。进行微生物基因组测序时，为了降低成本，往往须要把几十甚至上百株样品的DNA加上标签后混合测序。这对于群体遗传学研究是非常合适的，但限制了其在临床上的应用。第二个要解决的问题是测序前样本的快速处理。如果按照传统测序方法，先对菌株进行复苏培养，再大量提取DNA进行测序，其整个周期将仍然很长，难以体现快速全基因组序列分析的优势。尽管已有一些实验室
9、解决方案被提出，如上文中提到的利用MGIT方法对结核分枝杆菌快速培养测序21,以及在非培养条件下，对样本DNA进行富集后测序，或者直接进行宏基因组或者单细胞测序等32-33,但这些方法的大规模临床应用还存在技术和成本屏障。第三个问题是海量数据的储存管理及自动化分析。高通量实验技术使得数据产生相对容易，而对数据的解析和管理成为科研的瓶颈。尤其对于疾病防控工作者和医生来讲，在日常工作中去对大量数据进行深入分析是不现实的，必须开发数据库和自动化分析平台，实现从序列到结果解读的一键化;操作。可以设想未来传染病防控工作的一个场景：工作人员采集到患者体液样本，在实验室经过简单处理和平板培养，长出单菌落后，
10、将其分成两部分，一部分用于提取DNA测序，另一部分继续培养，进行表型试验。几个小时内获得测序结果后，可直接导入普通笔记本电脑预装的软件（或网络分析平台），软件在几分钟内自动给出标准格式的病原特性和溯源分析报告。测序分析结果与表型试验相互印证，为患者临床治疗和疾病流行控制提供迅速有效的指导。这个场景令人鼓舞与期待。1 Didelot X, Bowden R, Wilson DJ, et al. Transforming clinical mi-crobiology with bacterial genome sequencingJ. Nat Rev Genet,2012, 13（9）：601-6
11、12.2 Diep BA. Use of whole-genome sequencing for outbreak investiga-tionsJ. Lancet Infect Dis, 2013, 13（2）：99-101.3 Robinson ER, Walker TM, Pallen MJ. Genomics and outbreak in-vestigation: from sequence to consequenceJ. Genome Med, 2013,5（4）：36.4 Kao RR, Haydon DT, Lycett SJ, et al. Supersize me: ho
12、w whole-genome sequencing and big data are transforming epidemiologyJ. Trends Microbiol, 2014, 22（5）：282-291.5 Shapiro BJ, David LA, Friedman J, et al. Looking for Darwin s foot-prints in the microbial worldJ. Trends Microbiol, 2009, 17（5）：196-204.6 Loman NJ, Misra RV, Dallman TJ, et al. Performance comparisonof benchtop high-throughput sequencing platformsJ. Nat Biotech-nol, 2012, 30（5）：434-439.