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1、第九章核酸和蛋白质的生物合成教学目的：掌握中心法则的主要内容、掌握DNA的半保留复制、RNA的转录和蛋白质的生物合成过程，了解基因工程基础知识教学重点：DNA的半保留复制、RNA的转录、蛋白质的合成核酸和蛋白质都是生命的物质基础。核酸是生物性状的内在决定因素，蛋白质则是其外在表现。DNA是储存遗传信息的物质， DNA分子通过复制成完全相同的两个拷贝，亲代的遗传信息真实地传给子代；DNA分子中的遗传信息又如何表达呢？在生物的个体发育中，遗传信息由DNA通过转录传递到RNA，最后翻译成特异的蛋白质；在某些情况下RNA也能通过逆转录将信息传递到DNA。这就是中心法则的主要内容。第一节DNA的生物合成
2、一、半保留复制Watson和Crick于1953年提出的DNA双螺旋模型，碱基互补配对的原则，为DNA分子的复制提供了理论基础，DNA复制时，亲代DNA的双螺旋先行解旋和分开，然后以每条链为模板，按照碱基配对原则，在这两条链上各形成一条互补链，这样便形成了两个新的子代DNA分子。在新复制的DNA双链中，有一条是来自亲代DNA分子，另一条是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。这个半保留复制首先是由Meselson与Stahl在1958年用同位素15N在大肠杆菌培养试验中发现的，后来在其他生物细胞内也证实了其存在。二、DNA的复制过程DNA复制按一定的程序进行，双螺旋的DNA是边解开边合成新链的。
3、复制从特定位点开始双向进行。DNA双链的合成延伸均为53的方向，所以复制是半不连续的方式进行，即其中一条链相对地连续合成，称之为前导链。另一条链的合成则是不连续的，称为滞后链。整个合成过程如下：1、双链的解开实验证明：DNA的复制都是从某一特定位置开始的，这一位置叫做复制原点。该区域一般富含A、T两种碱基。首先由单链结合蛋白与复制原点相结合，然后双链被解开，形成一个“眼”状结构，在眼的两端出现两个叉子状的生长点，叫复制叉。原核生物基因组一般只有一个复制叉，而真核生物一般有多个，并且复制时可以在多个位点同时进行。2、RNA引物的合成在每一个复制原点，DNA的合成必须要一段RNA作为引物。引物是以
4、亲代DNA的单链为模板，在RNA聚合酶的催化下，合成一段含有50100个核苷酸的RNA短链。方向为53，与亲代DNA单链成逆向平行。3、DNA链的合成和延长亲代DNA双链分子是反向，一条链是沿53，而互补链则沿35方向。当原始的双链DNA在复制叉处打开时，新生DNA逆着模板链产生，即一个子代DNA链的生成方向为53，而另一个则为35。实际上，在以35链为模板时, 新生的DNA链以53方向连续合成,这条新生DNA链称为前导链。在另一条模板链（方向为53）上, DNA聚合酶以53方向合成小片段DNA(长度约1000个核苷酸), 然后将这些片段连接起来。这些片段根据发现者命名为冈崎片段。不连续合成的
5、DNA链称为滞后链。35 前导链5冈崎片段3滞后链54、切除引物、填补缺口，连接修复当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其上的RNA引物在核酸酶的催化下，先后被水解切掉。引物脱落后所留下的缺口，在DNA聚合酶催化下，用脱氧核苷酸配对填补上，再由DNA连接酶催化，把各短片段连接起来，并修复掺入DNA链的错配碱基。这样以两条亲代DNA链为模板，各自形成了一条新的DNA互补链，结果是形成了两个DNA双螺旋分子，每个分子中一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，故称为半保留复制。三、逆转录一般情况下，遗传信息流传递的方向是从DNA到RNA，即通过转录以DNA为模板生成RNA分子。在一些病毒体内，如鸟
6、类劳氏肉瘤病毒，小鼠白血病病毒等，在这些病毒中都存在有逆转录酶，可以以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA，这个过程叫逆转录。逆转录酶除需要以RNA为模板外，另外还需要以4种dNTP为原料，以短链RNA或DNA为引物，此外还需要适当浓度的二价阳离子Mg2+和Mn2+，沿53方向合成DNA，形成RNADNA杂交分子。以后，再以RNADNA杂交分子中的DNA链为模板，在寄生细胞的DNA聚合酶作用下，可合成另一条DNA互补链，这样便形成了新的双链DNA分子。几乎所有的真核生物的RNA分子的3末端都有一段多聚腺苷酸。当加入寡聚T作引物时，RNA就可以成为逆转录酶的模板，在体外合成与其互补的
7、DNA，称为DNA。这种方法已成为生物技术和分子生物学研究中最常见的方法之一，使逆转录酶得到广泛的应用。四、基因突变和DNA的损伤修复1、基因突变基因突变是指DNA碱基顺序发生突然而永久性的变化。其结果使DNA的转录和翻译也跟着转变，因而表现出异常的遗传特征。DNA的突变可以有以下几种形式：（1） 一个或几个碱基对被置换；（2） 插入一个或几个碱基对；（3） 一个或多个碱基对缺失。最常见的突变形式是碱基对的置换。突变有自发突变和诱发突变。自发突发主要发生在复制过程中，几率很低；诱发突变可以有物理、化学因素引起，如：电离辐射、紫外光、化学试剂脱氨剂和烷化剂等都可诱发突变。2、DNA的损伤修复由于
8、复制差错或外来理化因素的作用，使DNA分子中的碱基对遭到破坏的现象，称为DNA分子的损伤。其结果必将阻碍DNA分子的复制和转录，引起错股合成，最终导致细胞死亡。然而在生物细胞内存在着许多修复机制，对DNA的损伤具有一定修复能力。目前已知有4种途径：（1）光复活。这是一种高度专一的修复形式，其机制是利用光能激活光复活酶，切除嘧啶二聚体之间的CC键，而恢复原来的状态。它只作用于紫外线照射形成的产物。（2）切除修复。如果DNA损伤较严重，则必须进行切除修复，即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损的部分切除掉，并以另一条完整的链为模板，合成切去的部分，使DNA恢复正常。（3）重组修复。在重组修复酶的
9、作用下，含有损伤的DNA仍可进行复制，但在子代DNA链与损伤链相对应部位出现缺口，通过分子间重组，从完整的亲代或子代DNA链将相应的碱基顺序片段移至缺口处，然后用再合成的多核苷酸补上缺口。（4）诱导修复。许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理，均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS反应）。它包括DNA修复和导致变异两个方面。应急反应能诱导切除修复和重组修复中某些关健酶和蛋白质的产生，加强修复能力。此外应急还能诱导产物缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，但却带来了高的变异率。以上几种修复系统只有光复活是利用光能，其余均利用ATP水解释放的能量。第二节D
10、NA指导下RNA的生物合成1、概述DNA指导的RNA合成，即转录，RNA链的转录起始于模板DNA链的一个特定起点，并在另一终点处终止。此转录区域称为转录单位，一个转录单位可以是一个基因，也可以是多个基因。真核细胞是在细胞核中进行转录的，其中RNA和RNA在核质中被转录，RNA在核仁中被转录。原核细胞中没有细胞核，它是在含有DNA的拟核区进行转录的。在转录时，DNA双链中仅有一条链可作为转录的模板，其中用作模板的链称为反义链，另一条链则称为有义链，因为有义链的DNA序列正好与转录出的RNA的序列相同（只是T和U的区别），所以也被称为编码链。但各个基因的有义链不一定在同一条DNA链上。RNA的合成
11、沿53方向进行，催化转录的酶主要是RNA聚合酶，它由核心酶与因子可逆地结合为全酶。核心酶因子全酶核心酶主要催化RNA链的合成，而因子则起着在DNA上识别起始位点的作用。转录的反应物是四种三磷酸核苷，它们之间以磷酸二酯键相结合。2、转录过程（以原核细胞为例）（1）转录的启动。RNA的转录是从DNA模板上的特定部位开始的。RNA聚合酶的因子识别启动子特殊碱基顺序，导致RNA聚合酶与启动子特殊部位紧密结合，并局部打开DNA双螺旋，第一个核苷三磷酸底物插入转录起点部位，与模板配对结合，转录从此开始。所谓启动子，是指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。（2）RNA链的延伸。模板上转录起始点
12、第一位碱基一般是嘧啶，RNA新链5端第一个掺入的核苷酸则多为嘌呤核苷三磷酸，当与模板碱基互补的第二个核苷三磷酸的5磷酸基与第一个核苷酸的3羟基形成3，5磷酸二酯键，并释放出焦磷酸则开始了RNA链的延伸。随着RNA聚合酶沿模板35方向移动，DNA双链不断解开，与模板碱基互补的核苷三磷酸不断掺入，新生的RNA链就不断延伸。当新生的RNA延长到1020个核苷酸后，亚基从全酶上脱落，核心酶继续催化链的延伸。新生RNA链与模板DNA链形成的RNADNA杂交双链不稳定，核心酶移动过后留下的两条单链DNA有更强的复性能力，从而取代了杂交链中的新生RNA链，双链DNA模板恢复原来的双螺旋，RNA新生链便游离出
13、来。（3）转录终止。在DNA分子上（基因末端）有终止转录的特殊碱基顺序称为终止子，它具有使RNA聚合酶停止合成RNA和释放RNA链的作用。所有原核生物的终止子在终止点之前均有一个回文结构，其产物的RNA可形成由茎环构成的发夹结构，该结构可使聚合酶减慢移动或暂停RNA的合成。大肠杆菌的终止子有两类：一类称依赖于因子的终止子；另一类是不依赖于因子的终止子；因子能与RNA聚合酶结合但不是酶的组分。它的作用是阻止RNA聚合酶向前移动，于是转录终止，并释放出合成的RNA链。对于不依赖于因子的终止子，它转录的RNA链的末端为一边串的U。寡聚U可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板，并使RNA链释放。3、mRN
14、A的转录后加工原核生物中，多基因的mRNA生成后，绝大部分直接作为模板去翻译各个基因所编码的蛋白质，不再需要加工。真核生物编码蛋白质的基因以单个基因作为转录单位，不像原核生物那样组成操纵子，其转录产物为单顺反子，而不是多顺反子。真核生物里转录和翻译的时间和空间都不相同，mRNA的合成是在细胞核内，而蛋白质的翻译是在胞质中进行，而且许多真核生物的基因是不连续的。不边续基因中的不编码蛋白质部分，称为内含子；被内含子隔开的部分称为外显子。外显子和内含子一起被转录在一条很大的原初转录物RNA分子中，在核内加工过程中形成分子大小不等的中间物，因此它们被称为核内不均一RNA（hnRNA），其中至少有一部分
15、可转变为细胞质的成熟mRNA。真核细胞mRNA的加工包括：（1）hnRNA被剪接，除去由内含子转录来的序列，将外显子的转录序列连接起来。（2）在3末端连接上一段约有2030个腺苷酸的多聚腺苷酸（polyA）的“尾巴”结构。（3）在5末端连接上一个“帽子”结构m7GpppmNp。（4）在内部少数腺苷酸的腺嘌呤6位氨基酸发生甲基化（m6A）。第三节蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成是基因表达的结果。核糖体是蛋白质合成的场所，蛋白质合成体系主要由mRNA、tRNA、rRNA、有关的酶以及几十种蛋白质因子组成。一、蛋白质合成体系的重要组分1、mRNA和遗传密码（1）mRNA。mRNA从DNA分子转录了遗
16、传信息，起传递遗传信息的作用，所以称为信使核糖核酸。以mRNA为模板合成蛋白质。（2）遗传密码。组成mRNA有4种核苷酸，那么几个核苷酸编码一个氨基酸呢？实验证明，在mRNA链上相邻的3个核苷酸碱基为一组，编码一个氨基酸，称为密码子。因此，4种核苷酸碱基共可组成4364个密码子，其中除三个终止密码子外，其他61个密码子，每个可决定一种氨基酸。遗传密码有以下几个特点：编码性：61个密码子用来编码氨基酸，其中AUG即是甲硫氨酸的密码子，又是肽链合成的起始密码子。另外3个密码子作为肽链合成的终止信号。简并性：一个氨基酸可能有几个不同的密码子。密码子的简并性在生物物种的稳定性上具有重要的意义。通用性和
17、例外：各种不同生物都使用同一套密码，但线粒体的遗传密码去与通用密码不同。无标点性、无重叠性：无标点性是指两个密码子之间没有任何核苷酸隔开，无重叠性是指每3个碱基编码1个氨基酸，碱基不重复使用。摆动性：密码子的专一性主要是由前两位碱基决定的，而第三位碱基具有较大的灵活性。2、tRNAtRNA的主要功能是识别mRNA上的密码子和携带与密码子相对应的氨基酸，并将氨基酸转移到核糖体中，合成蛋白质。tRNA携带氨基酸的部位是氨基酸臂的3末端。在tRNA的反密码环上，有3个碱基组成1个三联体，叫做反密码子，能以互补配对的方式识别mRNA上相应的密码子。3、rRNA和核糖体rRNA和蛋白质结合成核糖核蛋白，
18、简称核糖体，是蛋白质合成的场所。核糖体有大小两个亚基构成。小亚基有供mRNA附着的部位，可以容纳两个密码的位置。大亚基有供tRNA结合的两个位点，一个叫做P位点，是tRNA携带多肽链占据的位点，又称肽酰基位点；另一个叫做A位点，为tRNA携带氨基酸占据的位点，又称氨酰基位点。二、蛋白质的合成过程多肽链的合成是从N端开始延伸的，mRNA上信息的阅读是从5向3方向进行。蛋白质的合成过程包括下面几个阶段：1、氨基酸的活化氨基酸必须经活化才能掺入多肽，这是多肽合成前的准备工作。氨酰tRNA合成酶催化这一反应，形成氨酰tRNA。AA+ATP+tRNA氨酰tRNA合成酶AA-tRNA+AMP+PPi这类酶
19、具有较高的专一性，即对氨基酸又对tRNA具有高度的选择性，以防止错误的氨基酸掺入多肽。一旦形成氨酰tRNA后，氨基酸的去向就由tRNA决定。2、肽链合成的起始mRNA、核糖体与活化的AA-tRNA结合生成起始复合物，这种过程相当复杂，需要多种起始因子和能源物质GTP的参与。在大肠杆菌等原核细胞中，合成多肽链的起始氨基酸都是甲酰甲硫氨酸fMet。mRNA链上的起始密码子常为AUG，它也是Met的密码子。起始tRNA和携带Met的延伸tRNA结构和功能不同，分别用tRNAf和tRNAm表示。细菌中多肽的合成并不是从mRNA的5端第一个核苷酸开始的，大多数转译是从第25个核苷酸以后开始的。过程如下：
20、（1）fMet-tRNAf 的合成。Met-tRNAf+N10-甲酰四氢叶酸甲酰化酶fMet-tRNAf四氢叶酸（2）70S起始复合物的形成。它需要核糖体30S和50S亚基；带有起始密码子AUG的mRNA；fMet-tRNAf；起始因子IF1、IF2、IF3；以及GTP和Mg2+的参加。起始复合物形成以后，核糖体上肽基部位（P位）已被fMet-tRNAf占据，并对着RNA上的起始密码子AUG，空着的氨酰tRNA部位（A位）准备接受一个能与第二个密码子配对的氨酰-tRNA，为肽链的延伸作好了准备。3、肽链的延伸这一阶段，与mRNA上的密码子相适应，新的氨基酸不断被相应特异的tRNA运至核糖体的A
21、位，形成肽链。同时，核糖体从mRNA的5端向3端不断移位以推进翻译过程（图14-4）。肽链延长阶段需要称为延长因子（elongation factors）的蛋白质，GTP，Mg2+与K+的参与。肽链延长阶段的具体步骤如下：（1）进位。与上一阶段所产生的复合物（70S起始复合体）A位上mRNA密码子相对应的氨基酰tRNA进入受位。此步需要肽链延长因子EFTu与EFTs。EFTu的作用是促进氨基酰tRNA与核糖体的受位结合，而EFTs是促进EFTu的再利用。（2）转肽。在肽基转移酶的催化下，将P位上tRNA所携的甲酰甲硫氨基（或肽基）转移给A位上新进入的氨基酰tRNA，与其所带的氨基酰的氨基结合，
22、形成肽键。（3）移位。核糖体向mRNA的3端挪动相当于一个密码子的距离，使下一个密码子（图14-4）准确定位在A位，同时带有肽链的tRNA由A位移至P位，此步需要肽链延长因子EFG(又称转位酶，translocase)、Mg2+与供给能量的GTP。近来发现核糖体在A、P位外，还有tRNA的另一结合位置，即tRNA排“出位（exit site, E位）”。氨基酰脱落后的tRNA先移至E位。（4）脱落。当A位进入新的氨基酰tRNA后，空载的tRNA从核糖体的E位脱落。以后肽链上每增加一个氨基酸残基，就需要进位、转肽、移位和脱落，如此一遍一遍地重复，直到肽链增长到必要的长度。 4、肽链合成的终止多肽
23、链合成已经完成，并且“受位”上已出现终止信号（UAA），此后即转入终止阶段。终止阶段包括已合成完毕的肽链被水解释放，以及核糖体与tRNA从mRNA上脱落的过程。这一阶段需要GTP与一种起终止作用的蛋白质因子释放因子（release factor，RF，或称终止因子）的参与。原核生物的RF有3种。RF1识别终止信号UAA或UAG，RF2识别UAA或UGA，RF3可与GTP结合，水解GTP为GDP与磷酸，协助RF1与RF2。RF使大亚基“P位”的肽基转移酶（转肽酶）不起转肽作用，而起水解作用。转肽酶水解“P位”上tRNA与多肽链之间的酯键，使多肽链脱落。RF、核糖体及tRNA亦渐次脱离。从mRNA
24、上脱落的核糖体，分解为大小两亚基，重新进入核糖体循环。核糖体大小亚基解离状态的维持需要IF3。5、真核生物翻译的特点真核生物的蛋白质合成与mRNA的转录生成不偶联；真核细胞蛋白质合成机构比原核生物复杂；真核生物的合成起始过程与原核生物的蛋白质合成有所不同；真核生物蛋白质合成的调控更为复杂；真核生物与原核生物的蛋白质合成可为不同的抑制剂所抑制。6、肽链的合成后加工与修饰某些蛋白质在其肽链合成结束后，还需要进一步加工，修饰才能转变为具有正常生理功能的蛋白质。（1）N端甲酰基及多余氨基酸的切除。（2）个别氨基酸残基的化学修饰有些蛋白质前体需经一定的化学修饰才能成为成品而参与正常的生理活动。有些酶的活
25、性中心含有磷酸化的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基。这些磷酸化的氨基酸残基都是在肽链合成后相应残基的-OH被磷酸化而形成的。除磷酸化外，有时蛋白质前体需要乙酰化（如组蛋白）、甲基化、ADP-核糖化、羟化等。胶原蛋白的前体在合成后，经羟化，其肽链中的脯氨酸及赖氨酸残基可分别转变为羟脯氨酸及羟赖氨酸残基。（3）蛋白质前体中不必要肽段的切除无活性的酶原转变为有活性的酶，常需要去掉一部分肽链。现知其它蛋白质也存在类似过程，虽然转变的场所不同；酶原多是在细胞外转变为酶，而蛋白质前体中不必要肽段的切除是在细胞内进行的。分泌型蛋白质如白蛋白、免疫球蛋白与催乳素(pro1actin)等，在合成时都带有一段称为“信号肽(signal peptide)”的肽段。信号肽段约由15-30个氨基酸残基构成。信号肽在肽链合成结束前已被切除。有些蛋白质前体在合成结束后尚需切除其他肽段。（4）二硫键的形成二硫键由两个半胱氨酸残基形成，对维持蛋白质立体结构起重要作用。二硫键也可以在链间形成，使蛋白质分子的亚单位聚合。