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1、中山大学硕士学位论文未甲基化CpG脱氧寡聚核苷酸（CpG ODN）对小鼠脾细胞产生IgE的抑制作用姓名：谢海瑞申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：李文益20070520叟！塑芏焦垒圭圭坚薹丝四鲢氢裹鐾挂萤酸鱼鲤盟：基硅塑照主垒！鲤控墅挂星未甲基化脱氧寡聚核苷酸（ ）对小鼠脾细胞产生的抑制作用临床硕士研究生：谢海瑞指导老师：李文益教授专业：儿科学摘要变态反应性疾病（ ）是指机体被某种变应原物质致敏后，再次与类似变应原性的物质接触后所产生的异常或过强的免疫反应所导致的疾病。笛床常见变态反应性疾病包括支气管哮喘、过敏性鼻炎和荨麻疹等。其中支气管哮喘在全世界范围内是最常见的慢性病之一，发病率呈上升
2、趋势。目前针对变态反应性疾病的治疗手段主要是药物对症治疗，传统的免疫治疗也因自身的局限性使其在临床的应用受到限制。因此寻求新的有效的治疗方法就显得非常重要。目前认为，变态反应性疾病是以型免疫应答为主的慢性炎症。近来研究发现，未甲基化脱氧寡聚核苷酸（，治疗变态反应性疾病取得了显著疗划。有研究认为， 是通过直接或问接激活多种免疫细胞，诱导产生型细胞因子，如、等，从而抑制型细胞因子、的产生川，进一步抑制细胞产生，抑制嗜酸细胞聚叟墅芏焦造圭圭里羹焦匹鲢氢塞塞丝竖酸哑业盟尘鼠鲤塑斑亡生醴煎地型拄旦集和活化。但亦有研究发现，去除或的作用， 仍然可以抑制变态反应的发生【。因此，有关 的作用机理还有待进一步研
3、究。为此，我们以小鼠脾细胞的产生为指标，从不同角度研究了 的抑制作用及其可能的机制，使得对 的认识更加全面，为临床治疗提供基础实验依据。材料和方法取正常雌性小鼠，制备单个小鼠脾细胞悬液或纯化细胞悬液，在存在或不存在情况下，用刺激培养细胞，用方法检测培养上清中产生的量，观察不同时间或不同浓度加入 对小鼠脾细胞或纯化细胞产生的影响。在 存在的情况下，用一刺激培养细胞，并分别加入抗或抗，收集培养天的细胞上清液，用方法检测产生的量，观察抗或抗对抑制产生作用的影响。在 存在或不存在情况下，用或不用标记后，再用刺激培养细胞，天后收集细胞，经相应荧光抗体染色后，使用流式细胞仪进行分析，观察 对细胞分裂和活化
4、的影响。结果未经任何刺激的正常小鼠脾细胞不产生，而当一刺激后能诱导细胞产生大量， 在 时开始抑制的产生， 时达显著抑制。 在培养小时内加入时，能完全抑制的产生，随加入时鱼！ ！塑茎丝迨主圭生基地匹鲢氢壅鐾篮笪壁四垡型越！基照麴照亡生！醇笪控剜缝旦问的推迟抑制作用呈逐渐减弱趋势。在给予 同时加入抗或抗单克隆抗体可使水平较单用 组明显增高，但与乙组比较仍明显减低）在纯化细胞培养组，明显抑制由刺激产生的，差异具统计学意义（）。未经任何刺激的小鼠细胞、和只有极少表达：经刺激后，细胞表面，的表达有所增加，而刺激组则显著地促进了、及的表达。未经任何刺激的小鼠细胞不发生分裂，在刺激下，细胞分裂次，而加入组细
5、胞只分裂了次。结论能够抑制刺激小鼠脾细胞和纯化细胞产生，其抑制作用呈剂量依赖性和时间限制性。抗和抗单克隆抗体不能完全拮抗 对产生的抑制作用。裂。显著促进了细胞活化，但抑制了刺激引起细胞分抑制产生的部分机制可能是通过直接作用于细胞发挥作用，而且可能与抑制细胞分裂有关。关键词：；：脾细胞；纯化细胞：小鼠叟塑生焦造童圭里差韭畦战氢壅基篮萱醴匿啦盟！基鲤塑墼芒生！匹鲣地趔韭旦 ： ： ： ， ， ， ， ， （） 【 ， ， ， ， ， 。， 叟！题茎焦遣童圭里茎丝匹雎氢蹇鐾筮萱醒立毪！盟！基鲤垫盥亡生蛭鲍娅劐佳围 ， ， ？ 一。 ， ， ， ， 鱼：！塑芏焦迨童圭里茎丝匠熊氢塞毽丝缱墼丛盟！基鲣塑
6、厘生生！畦地地剑韭盈 ， 叫一 （） ， （髓） ，一 、 ， ， ， ， 叟！塑生丝丝塞圭望墨伍匹胜氢蹇壅燕堑酸鱼堕堕盟尘基鲤麴墼！竺生！匝鲍控剜挂璺吖 ； ：； ；叟！：！墅芏焦堡圭圭里基丝匹题氲囊鐾攘篷酸西垡型越！鼠鳇垫照亡生！鳇曲娅趟挂里第章引言、变态反应性疾病概述变态反应性疾病包括支气管哮喘（哮喘）、变态反应性鼻炎、变应性皮炎、食物及药物过敏等。在变态反应性疾病中，以哮喘研究最多，其流行病学调查结果显示：随着环境污染、吸烟、食品工业发展和居民盛行室内装修，哮喘的患病率逐年升高，发病率在地区问有很大差异，欧美一些国家可高达，其中巴西、哥斯达黎加、秘鲁和乌拉圭。儿童的哮喘发病率在，澳大利
7、亚，每个岁以下的儿童中就有一个患哮喘。年抽样调查我国岁儿童哮喘的患病率平均为，“，年再次进行的抽样调查结果显示，哮喘患病率为，较之年前明显升高。世界卫生组织认为：全球哮喘发病率平均每年增加，全世界哮喘患者逾亿，每年死于哮喘的病人达万多【 。据比利时过敏研究所的估计，近十年来，西欧的哮喘患者增加了一倍。在美国，自年代初期以来，哮喘猛增了，因此说，哮喘是严重危害人类健康的重大疾病。随着对各种炎症性细胞及其介质，包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞在内的传统“结构”细胞及其分泌成分，细胞因子和粘附因子等的广泛而深入的研究，人们更加明确地认识到变态反应性疾病是由多种细胞、数十种炎性介质、细胞
8、因子参与的炎症过程。机体对特异性过敏原产生的超强免疫反应是变态反应性疾病的发病基础。而的产生在变态反应性疾病的发病过程中起着核心作用。目前普遍承认的变态反应的发病机制是：过敏原一抗原提呈细胞一细胞激活一类细胞增加一细胞激活一特异性分泌增加一与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的叟！墅芏焦亟塞圭里差丝啵雌氢塞塞拯蓝醒啦盟！基鲤塑照亡垒！匝曲地型挂围受体结合一诱导阶段效应阶段一再次进入体内的过敏原与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的结合一肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒一启动早期反应的病理过程（病人出现临床症状）一迟发期反应的病理过程。目前对于过敏性疾病的治疗手段主要从两个方面考虑：一方面尽可能找出变应原，避免与其
9、再次接触；另一方面，阻断或干扰变态反应的某些环节、从而防止其发生发展。目前，临床经常采用的治疗是：一、药物治疗，主要通过抑制前列腺素（）的产生（如阿司匹林肾上腺皮质激素）、抑制介质释放（如色甘酸二钠、肾上腺素、异丙肾上腺素、氨茶碱肾上腺皮质激素）、拮抗生物活性介质（如苯海拉明、扑尔敏、息斯敏、阿司匹林）、改善器官反应（如葡萄糖酸钙、肾上腺素、肾上腺皮质激素、抗胆碱药 受体激动荆）等途径来中和效应分子与炎症介质或抑制炎症细胞的功能来进行抗过敏治疗。随着制药工业的发展，药物治疗已使大多数哮喘、鼻炎等变态反应性疾病获得有效控制，但对部分患者控制并不理想。二、特异性脱敏疗法（变应原特异性免疫治疗），即
10、采用特异性变应原通过注射或其它途径多次接触患者，以提高机体对致敏原的耐受能力，从而达到患者接触较大剂量变应原也不发生临床症状的治疗方法。对于这种传统的免疫治疗，用于治疗变应性哮喘已有多年。尽管从理论上讲，它亦能下调反应，使已经存在的抗原特异性的反应向反应转变，从而抑制的合成。但在临床应用中，疗效不够明显，而且疗程长，使患者难以坚持，更令人不安的是抗原进入体内可能会引起严重的变态反应，故而传统免疫治疗在哮喘治疗中的地位受到严重挑战【，。因此，仍需寻找和探索新的治疗手段。、的研究概况以往人们一直认为，细菌不具有免疫原性，不能刺激免疫系统产生免疫应答。自年代，有人提出外源性的可以诱导免疫细胞产生干扰
11、素的假说后，直叟！塑茔焦迨主圭望茎丝匹照氢裹摧丝登壁鱼塑！盟坐基畦堡堕亡生延煎塑趔佳盟到年，等【发现，从卡介苗（）中提取的片段可以激活小鼠的自然杀伤（）细胞，诱导其分泌干扰素（），产生抗肿瘤活性，使人们对除基因遗传以外的另一重要功能，即的免疫学功能有了初步的认识。丽且研究发现，是细菌而不是脊椎动物的可以诱导细胞的激活。采用人工合成寡聚脱氧核苷酸的方法研究发现，具有免疫刺激活性的片段均含有非甲基化二核苷酸核心（“”代表磷酸二酯键）及其特定的侧翼序列，其结构特征为嘌呤嘌一嘧啶嘧啶的六碱基序列。等【 称之为基序（，等【 】称其为免疫刺激序列（ ，）。另外有人将含有基序的称为 ，将含有基序的寡核苷酸称
12、为。最近研究发现， 在小鼠【棚或猴子的哮喘或荨麻疹模型中可以阻止变态反应症状的发生。实验已证明， 可以腹腔注射【】，也可以气道栩、口服哪、经皮肤给药，不但可以抑制变态反应的急性发作所导致的气道高反应性、粘液异常分泌、平滑肌痉挛及气道内嗜酸细胞浸润等症状，而且阻止慢性进程【，并对具有遗传易感基因的新生鼠亦有划】。最近亦有报道，用豚草， 耦联抗原在豚草生长季节治疗过敏性鼻炎取得了一定的效果【。目前，尽管 的激活免疫应答方面的作用已经明确，但其作用机理并不十分清楚。研究认为， 对机体各种免疫细胞都具有免疫刺激作用，它通过内吞作用和或与样受体（）相互作用能直接影响细胞、巨噬细胞和树突状细胞。它能引起细
13、胞分化，直接刺激细胞分泌、等细胞因子和免疫球蛋白，诱导细胞表面共刺激分子的表达，包括 、和。能直接激活抗原递呈细胞（），包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，诱导其产生一、等型为主的细胞因子，并可上调和共刺激分子的表达。 不能直接活化叟！塑圭茎焦造圭圭型基丝匹避氢塞鐾焦萱酸畦坠鞋尘鼠硅墅照主生！曼鲤控剜拄围细胞。但它能在抗原提呈细胞存在时使淋巴细胞上类抗原与共刺激分子（、与）的表达上调，从而诱导型免疫应答。抑制型免疫应答，进一步来抑制的产生，阻止变态反应发生。大量动物的哮喘模型，】及人单个核细胞体外刺激试验，】也证明 使类细胞因子（、等）含量升高，而类细胞因子（如，等）及含量降低。但亦有研究证明
14、 对变态反应的抑制作用不依赖于类的细胞因子【。由此，我们推断， 也许还通过细胞因子网络以外的其他途径来实现抑制的产生，因此，我们以小鼠脾细胞的产生为指标，试图研究 在细胞群体水平、单个细胞水平上对细胞产生的作用，为临床应用研究提供了实验依据。叟！塑空垡篮圭圭塑薹氆匠鲢氢裹鏊毯篮四！啦！盟：基腔堡照主生匹鲍地题佳旦第章材料与方法动物来源雌性、鼠，周龄，购自中山大学医学部实验动物中心。主要试剂和材料 （）由上海生工生物工程公司合成，全链硫代磷酸化修饰，纯化。 抗小鼠单克隆抗体（）抗小鼠单克隆抗体（叫）抗小鼠乙单克隆抗体（）抗小鼠单克隆抗体（）抗小鼠单克隆抗体（）公司公司公司公司公司公司德国美国美国
15、美国美国美国抗小鼠单克隆抗体（）公司抗小鼠单克隆抗体（）公司美国美国底物抗小鼠 试剂盒或孔平底培养板公司公司公司美国美国美国公司美国牛血清白蛋白（）北京鼎国生物公司中国叟！兰兰！塑堂焦硷垂垂生基焦鲤照氢塞鐾篮萱酸！匹立型越基礁麴堕亡生！呈曲挫剜佳旦胎牛血清（）巯基乙醇青、链霉素培养液孔平底板主要仪器台式冷冻离心机一超净工作台二氧化碳培养箱倒置显微镜生物显微镜超低温冰箱 通用型酶标仪酸度计杭州四季清公司公司公司公司公司公司公司 中国美国美国美国美国美国美国德国新加坡英国日本日本美国美国德国旋涡震荡器高压灭菌锅德国日本 电子消毒柜康宝公司中国电子分析天平上海分析仪器厂中国电动移液器法国叟：题圭茎焦
16、鲎塞圭里薹焦鱼睦墅墨裹鐾丝董熊壁垒坠！盟！基睦塑墅芝生！畦盟越翻挂星流式细胞仪超声清洗机低温冰箱低温冰箱超纯水制备系统电热恒温水槽摇床（ ）主要试剂配制方法：配制：-25 -20，公司昆山超声仪器厂海尔公司海尔公司博迅公司美国中国江苏中国青岛中国青岛美国中国上海英国超纯水充分混匀，调值至，高压灭菌分钟，保存。液的配制：葡萄糖酚红 超纯水充分混匀，调到，过滤，分装，保存。叟 ：兰！一墅芏焦逢塞红细胞裂解液的配制：圭生羹些匹避氢裹鐾丝萱壁垂堕盟！匦畦塑照亡生！蛭曲弛劐拄盟超纯水充分混匀，调至，过滤，分装，保存。完全 的配制： 培养液（已灭活） 充分混匀，调为，无菌岬滤膜过滤除菌。保存。免疫磁珠分选细胞缓冲液