《自消旋naproxen酯或硫酯进行转酯化合成s-naproxen前驱药.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《自消旋naproxen酯或硫酯进行转酯化合成s-naproxen前驱药.doc（12页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、自消旋Naproxen硫酯進行轉酯化合成(S)-Naproxen前驅藥張春生Chun-Sheng Chang南台科技大學化學工程學系Department of Chemical EngineeringSouthern Taiwan University of Technology蔡少偉Shau-Wei Tsai國立成功大學化學工程學系Department of Chemical EngineeringNational Cheng-Kung University摘要在異辛烷溶劑中將(R,S)-naproxen硫酯與4-morpholine ethanol利用脂解酵素進行催化光學選擇之硫轉酯化反應
2、，同時利用三辛基胺將型硫酯自我消旋。可獲得超過65之產率及95光學純度之S型產物。當醇類濃度在5mM時有最大之初始速率顯示醇類為酵素抑制劑。水解旁反應之(S)-naproxen 其產率及水解初始速率可藉由提高醇類濃度及利用固定化酵素較一般酵素含水量較低之特性加以抑制。關鍵詞：動態分割、脂解酵素、硫轉酯化、Naproxen酯類、酵素、生物觸媒AbstractA lipase-catalyzed enantioselective thiotransesterifcation between (R,S)-naproxen thioester and 4-morpholine ethanol unde
3、r in situ racemization of the (R)-thioester by trioctylamine in isooctane was developed. More than 65% yield and 95% enantiomeric excess for the desired (S)-ester product were obtained. Maximum in the initial rate was found at the alcohol concentration of ca. 5 mM, which indicates the alcohol to be
4、an enzyme inhibitor. The initial hydrolysis rate and the yield of the undesired (S)-naproxen were suppressed by increasing the alcohol concentration or employing an immobilized lipase containing less water than the free enzyme.Keywords: Dynamic resolution; Lipase; Thiotransesterifcation; Naproxen es
5、ter; Enzyme; biocatalysis一、前言為了提高反應速率、轉化率及產品光學純度，一般常先將酯類反應物之官能基加以修飾，例如三氟乙基酯中三氟乙基吸電子能力最大，此種帶吸電子基之酯類稱為活化酯(activated ester)，且產生之三氟乙醇沸點低(沸點77 )分離容易，故較廣為被採用。以Porcine pancreatic 脂解酵素分割(R,S)-2-octanol為例，此類活化酯之反應速率比未活化酯大致快12個級數1。整個製程中除了產物的分離純化以外就是所餘50%未反應(R)-Naproxen反應基質的分離及消旋等繁複步驟，不過此種問題將利用動態動力分割加以解決。酵素催化動
6、力分割並同時連接消旋步驟是否可行，取決於反應基質能否被添加之消旋(racemase)催化進行消旋，或者反應基質對掌中心上之氫原子具足夠酸性，在中度或微鹼性條件下能夠去質子化(deprotonation)並再質子化(reprotonation)達到消旋目的。由於硫酯對掌中心上之氫較一般氧酯類之氫為酸，因此我們假設某些羧酸之硫酯對掌中心上之氫酸性足夠去質子化，於酵素催化動力分割下可同時進行消旋。由文獻發現，利用脂解酵素可對幾種硫酯進行動力分割但並沒有加入反應基質自我消旋的步驟2-4。對(R,S)-Naproxen而言，若酵素具有完全的選擇性，理論上可獲得100%的目標(S)-對掌異構物。以自我消旋
7、化為例，(R)-型及(S)-型基質間必須存在一可加成之中間物，故在鹼存在下，如圖1 所示，位置之氫原子必需脫離並產生中間物。由於醯基產生共振效應，得到穩定的另外四種無法加成(即具共振)的中間產物，然而當酯鍵中醇基由硫基取代時，由於氧原子與硫原子電子軌道不同，故無法得到具有共振效果能力之穩定中間體。此外若再加上位置帶有吸電子基如苯基、鹵素或奈基，則得到具有加成能力中間體之機會大增。基於這個構想，我們擬嘗試先合成硫酯，再進行硫轉酯化合成上述(S)-型前驅藥。動態動力分割中反應基質對掌中心上之氫之去質子化必需有鹼性環境配合才能進行自我消旋。由於本系統之反應環境為含微水量有機溶劑系統，無法以一般無機鹼
8、如氫氧化鈉調整pH值。但從文獻中得知，有機環境可用一些有機胺類如三辛基胺(trioctylamine)將反應環境控制在鹼性5,6，或者如Inagaki等利用陰離子交換樹脂當鹼觸媒，具有分離容易再使用方便之優點7,8。最近已有研究者成功將動態動力分割應用在-(phenylthio) propionic acid硫酯之光學分割，利用Pseudomonas cepacia 脂解酵素對基質的高選擇性，加入適量之三辛基胺保持基質於反應進行中保持充分的自我消旋，可達幾乎100% 的產率及96% 高光學純度之產物6。本文將從兩方面進行研究：(1)探討不同酯類對酵素轉酯化合成4-morpholinoethyl
9、 (S)-Naproxen酯類前驅藥產量提升之影響；(2)利用酵素硫酯轉酯化反應同時進行自我消旋，探討反應硫酯及有機鹼種類、醇濃度及溫度等操作變數對產量及消旋程度之影響。2.實驗2.1實驗藥品藥品皆為GR級以上，分別購自美國Aldrich、Tedia公司、德國Merck、Riedel-deHan公司與瑞士Fluka公司。2.2 酵素固定化程序1.秤取2 g固定化擔體Accurel MP1000進行前處理。2.秤取粗酵素約2.2 g，加入適量去離子水使濃度成為40 mg/ ml，於室溫下攪拌溶解30 min。3.將酵素溶液於室溫下離心10分鐘(3000 rpm)，取上清液50 ml加入已完成前處
10、理之擔體中，置於4 冷凍櫃中進行吸附。4. 吸附6小時後去除酵素溶液並以Bio-Rad Protein Assay定量溶液中酵素濃度。5. 將此已吸附酵素之溼潤擔體經液態氮冰凍約5分鐘固化殘餘水分後進行冷凍乾燥12小時。6. 冷凍乾燥完成後取下秤重並儲存於冷凍庫中。2.3 分析方法利用對掌性管柱 (Chiralcel OD, Daicel Chemical Industries, Ltd., Japan) 可將其(R)及(S)型酸與酯之對掌異構物分開。流動相混合物組成 (V/V) 正己烷: 異丙醇: 冰醋酸 (97:3:1) 且必需使用分子篩除水及流速為 1.0 mL min-1，；UV偵測器
11、波長設定在270 nm，操作溫度25。2.4 酯類篩選於15毫升異辛烷溶劑中分別配置3 mM Naproxen酯類如乙硫酯、丙硫酯、丁硫酯、苯硫酯、三氟乙硫酯9以及15 mM 4-morpholine ethanol，粗脂解酵素Lipase MY 20 mg mL-1，37 下以磁石攪拌進行反應，並在不同時間取樣以HPLC分析，篩選出具高選擇性及反應性之硫酯。另外以2 mM三氟乙酯及相同醇類濃度，分別以濃度5 mg mL-1之 C. rugosa及Lipsae MY粗酵素進行轉酯化反應，比較其反應性及選擇性。2.5 硫酯為基質時，自我消旋、脂解酵素與溶劑反應條件篩選濃度10 mM之不同硫酯於異
12、辛烷或環己烷中，分別加入不同有機鹼如陰離子交換樹脂或三辛基胺，在37及45 下進行消旋反應，比較自我消旋速率的快慢。配製3mM 苯硫酯或三氟乙硫酯，10 mM 4-morpholine ethanol濃度於異辛烷或環己烷，在37 下分別以20 mg mL-1 C. rugosa或Lipsae MY為觸媒，進行轉酯化反應，在不同時間取樣以HPLC分析，比較硫酯類基質在不同溶劑及酵素下反應性及選擇性。此外，亦比較此兩種硫酯在異辛烷及Lipsae MY 20 mg mL-1操作環境下，水解動力分割之反應性及選擇性。2.6 動態動力分割下酵素篩選以及醇類濃度影響於異辛烷中配製96 mM三辛基胺、3 m
13、M苯硫酯或三氟乙硫酯、4-morpholine ethanol醇類濃度3至60 mM、酵素Lipase MY(粗酵素或固定化酵素)有效濃度30 mg mL-1，於45下進行轉酯化反應，探討不同酵素製備方法及醇類濃度對反應之影響。3. 結果與討論3.1篩選酯類由於在30 異辛烷中三氟乙酯之飽和溶解度為2.6 M蔡慶憲, 1996，其較37 下Naproxen之飽和溶解度高出一萬倍以上，故可解決酯化反應時酸溶解度太低的限制，對於產物產量之提升助益極大，但仍有剩餘50%反應基質需進一步處理的缺點。比較Naproxen為基質之酯化與其三氟乙酯為基質轉酯反應酵素之k2/Km1值分別為0.0422與2.0
14、1 mL h-1 mg-110，顯示三氟乙酯具活化酯的特性，故顯現在後者之反應速率比前者大致快12個級數。表1顯示含直鏈烷基之乙、丙及丁硫酯之轉酯化反應性甚差且無水解旁反應發生，跟Naproxen與乙醇、丙醇或丁醇之酯化反應性相較甚遠11。由前者氧酯為基質結果比較，發現一般氧酯中若具有吸電子官能基則會產生加快反應速率，此部份即可推測由於吸電子效應使氧原子周圍電子雲變形進而降低進入酵素活化中心之空間障礙；然而硫酯之反應性變差，顯示當把氧原子置換成硫原子時，空間障礙增加許多，但若將直鏈烷基換成具吸電子性之苯基或三氟乙基，則可有效提升其反應性，但仍發現三氟乙酯之反應速率比三氟乙硫酯大約快12個級數。
15、綜合以上結果，可以發現硫原子外圍電子雲的確可能增加了進入酵素活性中心之空間障礙，不過當在醯基上加入具吸電子之官能基時，無論是氧酯或硫酯都會因此而降低氧或硫原子之空間障礙而提高反應速率。3.2硫酯為基質時，自我消旋、脂解酵素與溶劑反應條件篩選如表2所示，苯硫酯在異辛烷之反應性明顯高於環己烷，不同酵素活性表現則在環己烷時差異較大，不過對三氟乙硫酯而言，得到在不同有機溶劑及不同酵素之反應性及選擇性差異都較小。整體而言不同酵素之活性表現幾無差異，故如以往採用Lipase MY進行以下反應。然而有機溶劑之篩選除了考慮以上之結果外，尚必須考量其對自我消旋之影響才能決定。影響自我消旋除了有機鹼以外，溫度亦為
16、一重要因素，採用三辛基胺作為本實驗之有機鹼。如圖2所示，三氟乙硫酯自我消旋速度遠快於苯硫酯，由此判斷三氟乙基之拉電子能力應大於苯基，且溫度升高對自我消旋速度有加速之效應。綜合以上實驗結果得知：就反應性及選擇性而言，苯硫酯都略優於三氟乙硫酯但差異性不大；然而從量產的觀點著眼，反應基質之飽和溶解度必須加以考慮，在37 下異辛烷中苯硫酯酯之飽和溶解度則高出甚多，且自我消旋速率遠勝於苯硫酯。此外與環己烷比較，異辛烷能夠提供較佳之反應性及較快的自我消旋速度，所以在以下的一些探討中將採用三氟乙硫酯於異辛烷環境中之反應系統。3.3 動態動力分割中固定化酵素及醇類濃度影響如圖4所示，整體反應之初速率在醇類濃度
17、為5 mM有一最大值，但以水解旁反應為主。在低於15 mM醇類反應，發現水解反應速率VA,N大於轉酯化反應速率，隨著醇類濃度增加整體反應速率漸漸下降但轉酯化反應速率比例提高，可能原因除了醇類為酵素之抑制劑外尚有高醇類濃度下造成的酵素凝聚，此乃因醇類為較親水性與酵素周圍水份聚集所致。從圖5轉化率及產率加以分析，發現雖然自我消旋之效應顯著使最高總轉化率已達84.39%，但由於水解旁反應所佔比例甚多，所以(S)-酯類前驅藥無法超過50%，即使在醇濃度30 mM以上反應時間長達292小時亦是如此，此乃因為添加總量450毫克粗酵素其中含水量高達6.4% (W/W)，造成酵素周圍局部水濃度太高，使得水解旁
18、反應無法避免。 由於固定化酵素在製備過程可將含水量控制在較低的程度，而且分散性佳不會有凝聚的情形，因此嘗試將固定化酵素應用在此酯類轉酯化反應。如圖6所示，無三辛基胺時，使用固定化酵素可讓水解旁反應降至很低，但加入三辛基胺96 mM時水解旁反應卻依舊產生，因此進一步利用微水量分析儀分析三辛基胺含水量有0.14% (W/W)，提高有機溶劑中水濃度約2 mM，此含水量的改變可能是造成三辛基胺存在下高比例水解旁反應存在的原因。反應於290小時時將上述系統之醇濃度同時提升至75 mM，如圖6中箭頭處所示，我們可看到由於醇濃度的提高打破平衡，使反應繼續向右進行並且大幅降低Naproxen產率，進一步酯化合
19、成酯類前驅藥而突破50%的瓶頸。另外在光學純度方面，如圖7所示傳統動力分割在高轉化率時之低產物光學純度的缺點在此顯露無遺，其eeP,M值只剩75 % 左右；但三辛基胺存在下的動態動力分割最後除了高轉化率以外，亦擁有高達95 %之eeP,M值，優劣之分甚為明顯，因此對轉酯化反應而言高醇濃度有其必要性。比較圖4與表2可發現固定化酵素與粗酵素之活性表現差異很小，在高醇濃度時雖然都有醇類抑制現象但固定化酵素系統反應性只減弱53.22%，但粗酵素系統則減弱84.92%，顯示固定化酵素的確可避免在高醇濃度實驗過程可觀察到之粗酵素凝聚現象。因此以高醇濃度所進行之轉硫酯化反應，得到如圖8所示酯類前驅藥確實超過
20、50%且擁有高eeP,M值之結果。4. 結論由於製程仍受限於傳統動力分割之50% 最高轉化率。因此將反應基質由酸變成酯或硫酯除了大幅提升於有機溶劑之飽和溶解度，硫酯類基質更可利用動態動力分割達到接近100%之產率，並獲得以下1.酯類之醯基上加入具吸電子之官能基時，無論是氧酯或硫酯都會因此而降低氧或硫原子之空間障礙，進而提高反應性。此外由硫酯篩選結果得到苯硫酯及三氟乙硫酯有最好的反應性。2.自我消旋速率隨著有機環境之鹼性增強而變快，其中又以三氟乙硫酯最快。3.考慮反應性、飽和溶解度及自我消旋速率，以三氟乙硫酯為最符合動態動力分割要求之反應基質4.轉硫酯化反應過程中，可利用高醇濃度抑制所伴生之水解
21、旁反應程度，但粗酵素會因醇之親水性作用而使分散性變差降低活性。5.固定化酵素可克服粗酵素較高含水量以及於高醇濃度所產生凝聚之現象，故保持良好酵素分散性以及抑制水解副反應而使酯類前驅藥轉化率超過50%且擁有高eeP,M值。表1異辛烷中，以粗酵素Lipase MY 催化轉酯化反應，比較各種硫酯之反應性及選擇性。硫酯濃度3 mM、4-morpholine ethanol醇類濃度10 mM及酵素之濃度20 mg mL-1，反應溫度37 。乙硫酯丙硫酯丁硫酯苯硫酯三氟乙硫酯105(hr)eeS(%)1.120.500.5653.8438.07Xt(%)2.030.410.9336.6728.63eeP,
22、N (%)88.5577.71XN (%)3.323.08eeP,M(%)99999998.2493.18XM(%)2.030.410.9333.3525.55198(hr)eeS(%)1.900.651.2964.4847.52Xt(%)2.770.561.6441.2133.39eeP,N (%)88.7887.64XN(%)4.13.47eeP,M(%)99999997.7791.53XM(%)2.770.561.6437.1129.92XN為全部Naproxen之產率；eeS = (SB)-(SA)/(SB)+(SA)為反應物之光學純度；Xt為反應物之轉化率；eeP,N = (SA,N
23、)-(SB,N)/(SA,N)+(SB,N)為Naproxen之光學純度；XM 為4-morpholinoethyl Naproxen 酯類之產率表 2不同脂解酵素與有機溶劑對苯硫酯與三氟乙硫酯反應性及選擇性影響之比較。苯硫酯濃度3 mM、醇類4-morpholine ethanol濃度10 mM酵素C. rugosa 脂解酵素及Lipsae MY 20 mg mL-1，反應溫度37。反應基質酵素有機溶劑時間 (hr)6122448苯硫酯C. rugosa異辛烷0.030.050.130.21環己烷0.01.0.040.07Lipsae MY異辛烷0.030.060.120.18環己烷0.02
24、0.05三氟乙硫酯C. rugosa異辛烷0.030.060.120.20環己烷0.080.15Lipsae MY異辛烷0.020.050.110.19環己烷0.020.040.060.13表3. 異辛烷中使用三辛基胺，不同醇類濃度對三氟乙硫酯酵素反應之影響。三氟乙硫酯濃度3 mM，三辛基胺濃度96 mM，反應溫度45 ，固定化酵素Lipase MY 濃度30 mg mL-1。alcohol concentration (mM)1552.5Lipase MYVM(mM h-1)0.01660.0034VN(mM h-1)0.01690.0017VMVN-10.982.00Immobilized
25、 lipaseVM(mM h-1)0.01700.0119VN(mM h-1)0.01280.0025VMVN-11.334.76圖1硫酯類於鹼性環境下自我消旋，同時利用脂解酵素轉酯化合成(S)-Naproxen 前驅藥圖3異辛烷中進行動態動力分割，不同醇類濃度對三氟乙硫酯初速率之影響。三氟乙硫酯濃度3 mM，三辛基胺濃度96 mM，反應溫度45 ，粗酵素Lipase MY 濃度30 mg mL-1。VN（）表Naproxen之初始速率，VM（）表Naproxen 4-morpholinoethyl酯類之初始速率，Vt（）表三氟乙硫酯之初始速率。圖2異辛烷中使用三辛基胺，不同溫度對(S)型硫酯
26、自我消旋之影響。(S)型硫酯濃度1.5 mM，三辛基胺濃度96 mM，圓形及正方形依次表(S)型苯硫酯及(S)型三氟乙硫酯，實心及空心依次表反應溫度37及45 。圖4異辛烷中進行動態動力分割，不同醇類濃度對三氟乙硫酯轉化率之影響。反應條件同圖6，醇濃度30 mM以上之反應時間為292小時，其餘為192小時。XA,N表Naproxen之產率；XA,M表Naproxen 4-morpholinoethyl酯類之產率；Xt表三氟乙硫酯之轉化率，Xt = XN + XM。圖5異辛烷中，三氟乙硫酯進行酵素轉酯化反應。三氟乙硫酯濃度3 mM，固定化酵素濃度41.21 mg mL-1相當粗酵素Lipase
27、MY 濃度30 mg mL-1，4-morpholine ethanol醇類濃度15 mM，反應溫度45 。(, )依次表XM, XN，三辛基胺濃度96 mM ；(, )依次表XM, XN，三辛基胺濃度0 mM。箭頭處為將醇類濃度升至75 mM。圖7異辛烷中使用高醇濃度對三氟乙硫酯轉酯化反應之影響。三氟乙硫酯濃度3 mM，三辛基胺濃度96 mM，4-morpholine ethanol醇類濃度52.5 mM，反應溫度45 ，固定化酵素Lipase MY 濃度30 mg mL-1。 ( ) 表Xt； ( ) 表eeP,M；( ) 表XA,M為(S)-Naproxen morpholinoethy
28、l酯類之轉化率， ( ) 表XA,N為(S)-Naproxen之轉化率。圖6異辛烷中，三氟乙硫酯進行酵素轉酯化反應。三氟乙硫酯濃度3 mM，粗酵素Lipase MY 濃度30 mg mL-1，4-morpholine ethanol醇類濃度15 mM，反應溫度45 。( , )依次表Xt, eeP,M，三辛基胺濃度96 mM ；( , )依次表Xt, eeP,M，三辛基胺濃度0 mM。箭頭處為將醇類濃度升至75 mM。5.參考文獻1.Faber, K.,（1992） Biotransformations in organic chemistry, Springer-Verlag, German
29、y, 256-260.2.Iriuchijima, S., and Kojima, N. (1981) Asymmetric hydrolysis of 3-acetylthiocycloheptene and 3- acetylcycloheptene with a microbial lipase, J. Chem. Soc. CHEM. COMM., 185-185.3.Bianchi, D., Bosetti, A., Cesti, P. and Golini, P. (1992) Enzymatic resolution of 1,2-diols: preparation of op
30、tically pure dropropizine, Tetrahedron Letters, 33, 3231-3234.4.Frykman, H., hrner, N., Norin, T. and Hult, K. (1993) S-Ethyl thiooctanoate as acyl donor in lipase catalysed resolution of secondary alcohols, Tetrahedron Letters, 34, 1367-1370.5.Flling, G., and Sih, C. J. (1987) Enzymatic second-orde
31、r asymmetric hydrolysis of Ketorolac esters: In situ racemization, J. Am. Chem. Soc., 109, 2845-2846.6.Tan, D. S., Gnter, M. M., Drueckhammer, D. G., (1995) Enzymatic resolution coupled with substrate racemization using a thioester substrate, J. Am. Chem. Soc., 117, 9093-9094.7.Inagaki, M., Hiratake
32、, J., Nishioka, T. and Oda, J. (1991) Lipase-catalyzed kinetic resolution with in situ racemization: One-pot synthesis of optically active cyanohydrin acetates from aldehydes, J. Am. Chem. Soc., 113, 9360-9361.8.Inagaki, M., Hiratake, J., Nishioka, T. and Oda, J. (1992) One-pot synthesis of opticall
33、y active cyanohydrin acetates from aldehydes via lipase-catalyzed kinetic resolution coupled with in situ formation and racemization of cyanohydrins, J. Org. Chem.,57, 5643-5649.9.Liu, H. J., and Sabesan, S. I. (1980) Direct transformation of carboxylic acids to thiol esters induces by phenyl dichlorophosphate, CAN. J. CHEM., 58, 2645-2648.10.蔡慶憲, (1994) 有機溶劑中利用脂解酵素進行轉酯化合成(S)-Naproxen 前驅藥之研究, 國立成功大學化學工程研究所碩士論文.11.魏華州, (1992)微水環境中脂解酵素光學分割Naproxen之探討, 國立成功大學化學工程研究所碩士論文.1616