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1、高效液相色谱法 及其应用 赵建军,高效液相色谱法,基本概念 分离原理 系统结构 分析方法 实际应用,1903年 俄罗斯植物学家 Tsweet茨维特,植物色素 玻璃柱 CaCO3 石油醚淋洗,石 油 醚,色谱法（Chromatography）希腊语chroma(色)和graphos(谱),色谱分析法的定义,色谱分析法是一种物理化学分离方法,其分离原理是：溶于流动相(石油醚)中的样品(植物色素)各组分经过固定相 (CaCO3)时，其与固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等相互作用，且其作用的大小、强弱不同，导致在固定相中滞留的时间也不同，从而先后从固定相中流出，实现了不同组分的分离。当分离后
2、的组分由流动相携带进入检测器时，就得到了一个一个的色谱峰。,几个概念： 相(Phase):“相”是物理化学术语,特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面 固定相(Stationary Phase)：色谱柱内保持固定、起分离作用的填充物。 流动相(Mobile Phase)：流经固定相空隙或表面的液体或气体。 色谱柱：进行色谱分离用的细长管柱。,色谱分离理论,分离过程：组分赛跑,同时起跑 先后到达终点,这取决于色谱过程的热力学性质 、动力学性质 。,各组分的理化特性不同吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等相互作用的大小、强弱各不相同,分离原理：两相
3、分配,气相色谱法 超临界流体色谱法 纸色谱法 薄层色谱法 液相色谱法特别适用于分离沸点高和热稳定性差的物质,色谱分析类方法是分析化学的主流 液相色谱类方法是色谱中的主流,高效液相色谱法 (HPLC),High Performance Liquid Chromatography High Perssure Liquid Chromatography High Speed Liquid Chromatography 特点：高,高压：一般可以达到150300kg/cm2 高效：分离效能很高,操作简便易行。 高速：一般可达l10mLmin，分析一个试 样中的几个组分一般只要几到几十分钟。 高灵敏度：紫
4、外检测器的最小检测量可 达0.01ng 。高效液相色谱的高灵敏度还 表现在所需试样很少，微升数量级的样 品就足以进行全分析。 适用面广：有多种分离模式可供选择，可分 析80%有机化合物。 操作自动化,价格高：仪器设备相对较贵， 操作费用较高。,高效液相色谱仪,泵液,进样,分离,检测,记录,高压输液泵,往复型泵工作原理图,单向阀/红宝石球,泵体材料耐腐蚀,泵腔的体积要小，以便快速更换溶剂,能在高压下连续工作,耐压40-50MPa/ cm2,压力平稳，无脉冲,高压输液泵,输出流量稳定，重复性高,输出流量范围宽,手动进样器-六通阀/定量环,六通阀/定量环,通废液口,定量环,进柱,进样阀,样品,装样,
5、废液,淋洗液,至分离柱,（）,（）,样品环,因HPLC柱压高，需先将试样注入到色谱仪进样阀的采样环中，然后切换进样阀，将一定体积的试样注入到色谱柱的柱头。,进 样 系 统,取样时，流动相直接进柱，进样口与定量环连接，样品充满定量环后，多余样品流出。 进样时，泵将流动相压入定量环，将样品全部携带进入色谱柱分析。,色谱柱（固定相、填料）,色谱柱是色谱仪的心脏（起分离作用），其核心是优质的固定相（填料）。进行色谱分离的首要工作是选择性能良好和适宜的色谱柱，即在确定的分离条件下分离效率高和分析时间短的色谱柱。 色谱柱的选择应考虑： 固定相类型的选择, 主要取决于样品及其分离模式； 柱填料的结构, 主要
6、指颗粒的形状大小、均匀性、比表面、平均孔径和孔容等； 柱规格指柱内径、柱长度和填料粒度,色谱柱的分离效率（简称柱效），可定量地用理论塔板数N来表示。,理论塔板数N,柱效检测,次序：尿嘧啶/苯酚/ 4-氯硝基苯/甲苯,Agilent XDB-C8柱：4.6 150mm, 5m,高效液相色谱检测器,近几年出现的蒸发激光散射检测器（ELSD）有望成为高效液相色谱全新的通用灵敏的质量检测器。,可变波长的紫外吸收检测器,检测器(detector)的主要性能要求： 灵敏度（sensitivity）高（检测限低） 噪音（noise）低 线性范围（linear range）宽 重复性（repeatabilit
7、y）好 适用范围广（通用型、专属型）,峰的检测,色谱工作站：把模拟信号转换成数字信号, 然后采用色谱软件处理，给出色谱图等信息。,进样器,高压泵,流动相,色谱柱,检测器,数据处理,互 动 控 制 功 能,建立高效液相色谱分析方法,根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。 选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。 选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。 由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。,高效液相色谱方法开发 与色谱条件优化,色谱法：是一种用来分离、分析多组分混合物的极为有效的物理化学分析方法。 广泛
8、用于化工、食品、医药、生化、卫生、环境保护和高能化合物等生产和科研工作中。,高效液相色谱的应用,色谱图和色谱峰参数,色谱图：试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号时间曲线或信号流动相体积曲线，称为色谱流出曲线或色谱图。 色谱图由基线和若干色谱峰所组成。,色谱图相关术语,色谱峰: 当组分随流动相进入检测器时，其响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线，正常的色谱峰呈正态分布。 基线 : 在操作条件下，仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。,色谱峰,基线 ,峰高,峰宽,时间(分),响应值,峰高：色谱峰顶点与峰底之间
9、的垂直距离称为峰高(peak height)。用h表示。 峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面积(peak area)，用A表示。 峰底宽度（W）自色谱峰上升沿和下降沿的拐点所作切线在基线上的截距。 半峰宽（Wh）峰高一半处的色谱峰宽度。注意，W =1.70 Wh。,保留时间(retention time, tR)从进样开始到检测器测到某组分信号最大值(即流动相中该组分的浓度最大值)时所需的时间。 死时间(dead time, t0) 完全不溶解于固定相因而不被固定相所保留的组分从进样到该组分信号最大值出现时所需要的时间。 校正保留时间(adjusted retention time ，tR)
10、组分的保留时间减去死时间。,R=1 分离程度达95.4% R=1.5 完全分离,达=99.7 也叫基线分离 R1 二峰明显重叠,分离条件的优化： 分离度(resolution，R)-相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。,色谱参数的用途：,根据保留值可进行 定性分析； 根据峰高或峰面积可进行 定量分析； 根据色谱峰的保留值和峰宽参数 可以评价色谱的分离效率。,高效液相色谱分析方法,定性分析方法 定量分析方法： 外标法、内标法,外标法-标准曲线法,具体作法： 用待测组分标准物制备一系列标准溶液，在选定的色谱条件下取一定体积的标准溶液进样分离，用待测组分的峰面
11、积对浓度做标准曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。 分析试样时，在相同的色谱条件下取同样体积的试样进样分离，由所得待测组分的峰面积，从标准曲线上查得待测组分的含量。 特点： 外标法操作简单，适合大批量试样的分析。但是，进样量等实验条件对测定的准确度有很大的影响。,内标法,方法：选择一种试样中不存在的物质作为内标物，将一定量的内标物加入到准确称量的试样之中，混匀后取一定体积进样分离，通过外加的内标物与待测物的峰面积、校正因子之间的比例关系，由内标物的量来确定待测物的量。 优点：不受试样中的各组分是否都出峰的限制，也可以消除由于进样量和其它实验条件的波动对定
12、量的影响。 缺点：每一个试样均需加入一定量的内标物，增加了测定的工作量。,内标法在色谱分析中是一种常用的定量分析法。它尤其广泛的应用于高压液相色谱中。这种方法可以抵消仪器和过程带来的误差。 将一定量的某种纯物质，作为内标物加入到已知重量的样品中，进行色谱分析，内标物在色谱图上得到分离的峰。根据已知含量的内标物的峰面积和样品的峰面积，计算组分的百分含量。 只要主要组分能被分离和能被检测就可使用这个方法，一些次要组分成为重叠峰或者对检测器无响应就可以允许存在。,不过，内标物的选择要符合以下要求： （1）内标物的峰与组分峰能完全分离 （2）内标物峰在色谱图上出现的位置，最好在欲定量组分峰的邻近位置。
13、如果样品中有几个组分需要定量，并且他们的k之差别较大，这时就需要用几个内标物来作定量测定。 （3）内标物的性质和浓度尽量与预测定峰的接近。 （4）内标物是样品中不存在的，与样品各组分、柱填料和移动相不发生化学反应。 根据组分百分含量与其色谱峰面积成正比的关系进行计算：,HPLC的日常操作条件,最好是恒温、恒湿 温度：1530 相对湿度80% 房间应有良好的通风 避免光线直射 远离高电磁干扰、高振动设备,优良的常规操作,样品处理、 预先稀释：使用流动相溶解样品 - 减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要 - 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀,样品瓶,进样前准备
14、,0.45m 滤膜,样品过滤,流动相的选择（超纯水 、乙腈 ）, 采用 “HPLC” 级溶剂。 对试样有适宜的溶解度。 溶剂粘度要小与固定相不发生化学反应。 溶剂与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用溶剂的适宜波长应在检测波长范围内。,流动相脱气,吹氦脱气法,抽真空脱气法,超声波脱气法,在线真空脱气法,溶剂吸滤头的清洗,1.取下吸滤头放在(1:4,V/V)的硝酸溶液烧杯中超声清洗15分钟; 2.取出后用蒸馏水超声清洗10分钟; 3.用吸球吹出吸滤头中的液体; 4.再用蒸馏水超声清洗10分钟; 5.用吸球吹净吸滤头中的水份; 6.将吸滤头重新插入管路并放入溶剂瓶中(正相系统注意将吸滤头烘干),
15、流程,5重新连接色谱柱，设定适当流速，当流动相流出约30倍于色谱柱体积，并且检测器基线平衡后，流动相更换完毕,流动相的更换更换互溶流动相,1将新流动相置于储液瓶中(已过滤和超声处理的),2打开排空阀，启动泵,使新的流动相从排空阀出口流出20ml左右,3关闭排空阀，然后将进样阀与色谱柱相连接端卸开，用小容器放置于进样阀的出口处,4启动恒流泵，让流动相从进样阀出口流出10ml左右,泵的使用与维护注意事项,防止任何固体微粒进入泵体（用0.22um或0.45um的微孔滤膜过滤） 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。 泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵
16、运转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、密封圈，最终产生漏液 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力 流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性和分析结果。,色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动,色谱柱的保养,瞬间压力剧烈变化,当柱子和色谱仪联接时，阀件或管路一定要清洗干净 要注意流动相的脱气 避免使用高粘度的溶剂作为流动相 进样样品要提纯 控制进样量 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品 每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱 当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存（一般为甲醇）,常见问题 分析原因 解决办法,峰形展宽,“鬼峰”,脱尾峰,双重峰或 分叉峰,实验1：高效液相色谱图及其参数的测定 实验方法： 实验2：高效液相色谱法测定水中苯酚类化合物 实验方法：,