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1、放线菌新种分离鉴定,1,行业精制,1、实验目的,本实验通过对分离得到的放线菌新种从形态学、生理生化反应特征、和分子遗传分类学方面进行鉴定，证明其是以前从未发现的新种。,2,行业精制,2、实验方法,2.1 分离方法,2.3 鉴定方法,2.2 16SrRNA基因序列测定,3,行业精制,2.1 分离方法,近年来出现了胞外多糖胶与动孢溶液相结合的分离方法、再水化-离心 法、极高频辐射法、噬菌体定向分离法和蔗糖梯度离心法等用于稀有放线菌选择性分离的方法。,4,行业精制,2.2 16SrRNA基因序列测定,放线菌基因组的提取 16SrRNA基因扩增 胶回收 连接 转化 测序研究,5,行业精制,2.3.1
2、表观特征,6,行业精制,A. 电镜,取菌体后,3%戊二醛固定4h, 0.1M磷酸缓冲液漂洗。 酒精梯度脱水，在30%、50、70、80%、100依次脱水，其中100酒精2次，每次10min。 乙酸异戊脂置换，50%一次，100%两次。 Eiko公司XD-1型二氧化碳临界点干燥器干燥，Eiko公司IB-3型离子镀金仪喷金镀膜。 JEOL公司JSM-840扫描电镜观察。,7,行业精制,B. 培养特征,参照国际链霉菌规划中有关放线菌的培养特征描述所采用的标准培养基进行培养特征测定。 所用培养基有:ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏琼脂、马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂，平板接种，28培养7，14，
3、21，28d后分别观察并记录基内菌丝、气生菌丝的生长情况及可溶性色素。,8,行业精制,C. 生理生化实验,生理生化特性的测定主要包括: pH、盐浓度和温度耐受性，明胶液化，淀粉水解，脲酶的产生，牛奶胨化和凝固，硝酸盐还原，H2S的产生，黑色素的产生，唯一碳、氮源利用等试验。,9,行业精制,a. pH、盐浓度和温度耐受性,pH耐受实验 在高氏一号培养基中分别加入pH缓冲液，空白培养基作阴性对照，28培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。,温度耐受实验 将菌株接种在高氏一号培养基上，分别在4、10 、16 、20 、28、37、45培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。,盐耐受实验 高氏一号培
4、养基内加入不同浓度的NaCI(l%，3%，5%，7%，10%，15%，20%)28培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。,10,行业精制,b. 明胶液化,取明胶培养基试管作穿刺接种，另有两支不接种作空白对照。于28C培养箱中培养。 培养2、7、10、14和30天的试管，放入4C冰箱或置于冷水中30min，然后进行观察。 如明胶凝块部分或全部变为可流通的液体，则明胶水解阳性。 如明胶凝块呈固体，则明胶水解阴性。 若菌体未生长，可能是不能在明胶培养基上生长。,11,行业精制,c. 淀粉水解,将菌株点种在淀粉琼脂平板上，待菌落生长良好时，在菌落周围滴加碘液检测淀粉水解酶活性的强弱。 滴加碘液后培养
5、皿背景呈蓝黑色,菌落四周若不变色，或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培养基仍不变色，表示淀粉水解阴性；若变成透明无色则为阳性，说明产生淀粉酶水解淀粉。,12,行业精制,d. 脲酶的产生,e. 牛奶凝固与胨化 将待测菌种接种在脱脂牛奶管中，观察牛奶凝固与胨化现象。 若牛奶有凝块则为凝固，继续培养，凝固后有液体出现，进一步水解成液体，则为胨化，一般先凝固后胨化。,有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。,挑取1824h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，培养
6、14d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红色为阳性。,13,行业精制,将待测菌种接在硝酸盐液体培养基中，置室温下培养，1、3、5d取样测定。每株菌作复本，另两管作对照。 培养液中加入格里氏试剂A、B液各一滴，如呈现粉红色、玫瑰红色，表明硝酸盐还原阳性，如无红色出现，则加1，2滴二苯胺试剂，如呈蓝色，表示培养液中仍有硝酸盐存在，硝酸盐还原属阴性，若不呈蓝色，表示硝酸盐和亚硝酸盐都已还原成其他物质，仍按阳性结果处理。,f. 硝酸盐还原试验,14,行业精制,g. H2S的产生 某些细菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而产生硫化氢气体，若于培养基中加入柠檬酸铁铵或醋酸铵，则与硫化氢
7、作用生成硫化亚铁或硫化铅（黑色）沉淀。 h. 黑色素的产生 将供试菌株接种在酪氨酸培养基斜面管上，培养 7 d 和 14 d 观察结果，培养基被染成褐色或者黑色即说明该菌产生黑色素。,15,行业精制,i. 碳源利用和氮源利用（本实验利用BIOLOG板）,碳源：D-葡萄糖，蔗糖，L-树胶醛糖，D-果糖，D-木糖，鼠李糖，I-肌醇，棉子糖，D-甘露醇，纤维素。 不加碳源的基础培养基作为阴性对照。,氮源: KNO3，NaNO2，尿素， (NH4)2SO4，丝氨酸，烟酰胺，酪氨酸， DL-天冬氨酸，L-甲硫氨酸，DL-丙氨酸，L-精氨酸，L(+)-谷氨酸，甘氨酸，L-苯丙氨酸，腺嘌呤。 不同氮源按0.
8、5%的浓度加入，培15天后，将各种氮源上的生长状况与不加氮源的基础培养基上的生长状况作比较。,16,行业精制,2.3.2 化学分类,17,行业精制,A.细胞壁化学组分,放线菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，根据肽聚糖分子中肽链第3位氨基酸的种类，种间肽桥和邻近的四肽交联的位置来决定放线菌细胞壁型的划分。 Lechevalier等（1976）根据放线菌细胞壁的化学组分和全细胞水解液糖型，将放线菌归为9个主要类群和4个糖型。,18,行业精制,放线菌细胞壁的主要构成（Lechevalier，1976）,19,行业精制,放线菌全细胞的主要糖类型（Lechevalier，1976）,20,行业精制,全细胞TL
9、C分析实验流程：,21,行业精制,磷酸类脂位于放线菌细胞膜上，属于极性脂。不同属菌的磷酸类脂组份是不同的，它是鉴别属的重要特征之一，是化学分类项目中不可缺少的分类指征。磷酸类脂的种类繁多，但用于分类的指征并不多。 用于分类指征的磷酸类脂只有五种： 磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine,PE） 磷脂酰甲基乙醇胺（phosphatidyl methyl ethanolamine,PME） 磷脂酰胆碱（phosphatidyl choline, PC） 磷脂酰甘油（phosphatidyl glycerol ,PG） 含葡萄糖胺的未知结构磷酸类脂（phospholipid
10、s of unknown structure containing glucosamine, GluNu）,B. 磷酸类脂测定,22,行业精制,称取1g湿菌体于带螺口的40 ml离心管中。 加入15ml甲醇。 100水浴10 min，自然冷却。 加入10 ml氯仿和6 ml 0.5%NaCl。 用力摇匀10 min，静止可看到分层。 8000 rpm，离心10 min。 到入分液漏斗静止分层，取下层。 30-40旋转蒸干。 分两次各加入200l氯仿/甲醇（2:1）冲洗器壁。 液体移入EP管（约100-200l）,8000 rpm，离心10 min，去沉淀。 4保存备用。,细胞磷脂的提取,23,
11、行业精制,实验流程：,24,行业精制,C. 甲基萘醌测定,大多数细菌含有甲基萘醌或泛醌，或两者均有。包括放线菌在内的革兰氏阳性细菌只含甲基萘醌。 放线菌及有冠军的甲基萘醌异戊烯侧链长度和氢饱和度变化相当大，多为部分饱和，含有7-12个异戊烯单位。 放线菌目中不同菌属的甲基萘醌类型如下表所示。,25,行业精制,放线菌目中甲基萘醌类型,26,行业精制,菌体的收集制备 待测菌株用液体培养基培养，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤两次，菌体于-80冷冻3d，冷冻干燥机抽干菌体，冻干菌体4干燥器保存备用。 醌的提取及纯化,27,行业精制,D. 脂肪酸测定,放线菌细胞中脂肪酸的链长、双键位置和数量及取代基团具有分
12、类学意义，是一项重要的分类特征。 脂肪酸组份一般较为复杂，分别归属3种类型： 直链饱和与不饱和、分枝和复杂形式的脂肪酸。 脂肪酸分析应在标准化的条件下进行，因为不同组分的相对含量因菌龄和培养条件的不同而异。 脂肪酸定性分析结果限于属和属以上的分类；脂肪酸定量分析可为种和亚种分类提供有用的基本资料。,28,行业精制,2.2.3 基因型分类,29,行业精制,A. G+C%含量分析,DNA 碱基组成比例（G+C mol%）是十分典型的基因指征之一，一般认为 G+C mol%在种内相差不会超过 3%，在属内不会超过 10%。 大量分析结果表明：放线菌属于高 GC 含量的微生物，并且 G+C%变化范围小
13、，最多不会超过 30%。由于 G+C%在不同物种中均是比较恒定的，因此可作为诸多分类指征中不可或缺的一个，常常作为属的分类鉴定标准之一。,30,行业精制,HPLC实验：,实验条件：1.0ml/min 37C 柱子：C18反相柱 溶剂：12%甲醇 20mM磷酸三乙胺（pH5.1）,20mM磷酸三乙胺（pH5.1）配制： 三乙胺（99%）用水稀释，用85%磷酸调pH至5.1，即0.5M磷酸三乙胺 40ml 0.5M磷酸三乙胺（pH5.1）与750ml glass-distilled water混合，再加入120mlHPLC-grade甲醇，再加入水至总体积为1L。 不用柱子时，流速减至0.1ml/
14、min 当仪器超过3天不使用时，柱子先用水清洗，再用70%甲醇清洗。,31,行业精制,B. DNA-DNA分子杂交,DNA-DNA分子杂交可以在基因组水平上研究微生物间的区别与联系，用于种水平的分类学研究和新种的确立。 1987 年，国际系统细菌学委员会规定： DNA 同源性70%或者杂交分子的热解链温度差 Tm5作为细菌种的界限。 在放线菌分类中，DNA-DNA杂交已被确定为建立心中的必要标准之一。,32,行业精制,DNA杂交法的基本原理是用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链DNA，然后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。 如果两条单链DNA的碱基顺序全部相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率为100%。如果两条单链DNA的碱基序列只有部分相同，则它们能生成的“双链”仅含有局部单链，其杂合率小于100%。由此，杂合率越高，表示两个DNA之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。,33,行业精制,C. 16srRNA基因序列分析及进化树的构建,将所得到序列利用Blast软件在GenBank，NCBI等数据库中进行相似性搜索，选取同源性比较高的典型菌株的 16SrRNA序列作为参比对象，然后用MEGA 4软件构建供试菌与参比菌之间的系统进化树。,34,行业精制,