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1、Western Blot操作步骤1、细胞总蛋白的提取用胰酶-EDTA将贴壁生长的细胞消化，用PBS溶液洗3次，弃去PBS溶液后，加入适量体积的蛋白提取液（1ml预冷的Lysis Buffer加入5l磷酸酶抑制剂1l蛋白酶抑制剂和5l 100Mm PMSF，三种试剂均放在制冷盒中）后，旋涡振荡器混匀，冰浴振荡15min（将摇床放在冰箱中）。于4，12000rpm离心20min，收集上清液，分装于Ep管中（一般每管100ul），-80保存（保存时间短-20即可）。可取少量蛋白用于蛋白定量（做比较时一定得定量：考马斯亮蓝染色酶标仪595nm测光密度）。2、配制12%分离胶（总体积为7ml）配置前先将
2、胶板洗净（肥皂水洗-双蒸水冲-无水乙醇冲），晾干后用封口膜封好底部及侧面（如有凡士林可先涂之再封更保险），放在支架上夹好。取三蒸水2340ul，30%丙烯酰胺2800ul，分离胶buffer 1750ul（小分子量蛋白用15%分离胶：分别为三蒸水1680ul；30%丙烯酰胺3500ul；分离胶buffer 1750ul），SDS 60l，TEMED（四甲基乙二胺，避光保存） 6l，10%过硫酸铵（现用现配或4避光保存不超过两周）30l。混匀后，倒入放置好的胶板中。在液面上加一层无水正丁醇，使液面平整。待胶完全凝固后，倒掉正丁醇，用三蒸水冲洗几次，其余液体用滤纸吸净。3、配制5%浓缩胶（总体积为
3、2ml）取三蒸水1100ul，30%丙烯酰胺333l，浓缩胶buffer 500ul，SDS 20l，TEMED 4l，10%过硫酸铵20l，混匀后，加在分离胶的上层，插入梳子（注意不要有气泡），待胶凝固。4、处理蛋白样品自冰箱中拿出蛋白样品，加入5上样缓冲液（蛋白样品与缓冲液总量为30ul：6ul/24ul，如果蛋白量体积够的话，总体积40ul，marker用20ul），将小管盖好盖后用封口膜封好以防止煮沸过程中开盖导致稀释，插在专用有孔泡沫上，在沸水中煮3-5min（锅盖打开）5、上样待浓缩胶完全凝固后，将封口膜取下把胶板放于电泳槽中。加入电泳缓冲液（加满），拔出梳子，用微量加样针在各加样
4、孔中加入适量体积的处理过的蛋白样品（加样针先插入底部然后慢慢上移缓慢加样）。若有不用的加样孔，可加入上样缓冲液（如：缓冲液-蛋白样品-marker-缓冲液-蛋白样品-缓冲液，将顺序记在本上）。6、电泳：接通电源，进行电泳（根据分子量大小设置电压，分子量小采用低电压以降低电泳速度）。一般溴酚蓝跑到底部时结束电泳（因电泳时产热，电泳仪周围最好放置冰袋）。7、转膜电泳结束后，将含有目的蛋白的分离胶切割下来，放入转移缓冲液中；根据胶的大小剪裁等面积的6张滤纸（略短于胶1mm）和1张PVDF膜（大于20KD的蛋白勇0.45um的膜；小于20KD的蛋白就要用0.2um的膜），剪裁的PVDF膜可比胶的长宽各
5、长出1mm左右。6张滤纸放入转移缓冲液中；PVDF膜先放入甲醇中活化（不能超过15sec），再放入转移缓冲液中平衡15min后（若检测小于20KD的蛋白缩短或省略平衡步骤），依次在石墨电极上叠放3张滤纸、PVDF膜、SDS-PAGE凝胶和另外3张滤纸，用玻璃棒赶出气泡。接通电源，40min60min转膜结束(根据分子量大小定时间，分子量大可增加转膜时间)。8、封闭：将转移后的PVDF膜放入5%脱脂奶粉或1%BSA中（小袋），振荡封闭至少1h。9、与一抗结合用抗体稀释液将一抗按1：10002000稀释。将PVDF膜直接放入一抗稀释液中（小袋），室温振荡孵育2h或4过夜。10、洗膜：用TBST洗膜
6、，10min/次，共3次。11、与二抗结合将洗后的PVDF膜放入二抗溶液中，二抗的稀释度为1：20005000。室温振荡孵育1h。12、洗膜：用TBST洗膜，10min/次，共3次。13、化学发光、显影、定影此操作在暗室中进行。将发光试剂A和B等体积混合后加在PVDF膜的蛋白面上，室温下孵育3min。将PVDF膜用保鲜膜包好放在暗盒内（必须保持干燥）。在红灯下取出X胶片，放在膜上，根据信号的强弱调整曝光时间。曝光结束后取出X胶片（从30sec开始试），浸入显影液中显影，显影25min，用水终止显影。然后将X胶片浸入定影液中，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。14、结果处理
7、：将胶片进行拍照。用凝胶图象处理系统分析目标带的光密度值。附：用于Western blot实验所需溶液的配制1、30%丙烯酰胺贮存液：称取14.5g丙烯酰胺和0.5g N-N-甲叉双丙烯酰胺，将其溶于50ml三蒸水中，棕色瓶中避光保存。2、SDS-PAGE电泳缓冲液：称取14.4g甘氨酸，3g Tris碱和1g SDS溶于1L三蒸水中，不用调pH。3、分离胶缓冲液（4） 1.5mol/L Tris-Cl pH8.8称取18.15g Tris碱，将其溶于80ml三蒸水中，用浓盐酸调pH到8.8（约需浓盐酸45ml），加三蒸水至100ml。4、浓缩胶缓冲液（4） 0.5mol/L Tris-Cl
8、pH6.8称取6g Tris碱，将其溶于80ml三蒸水中，用浓盐酸调pH到6.8（约需浓盐酸3ml），加三蒸水至100ml。5、10%过硫酸铵：称取0.1g过硫酸铵溶于1ml水中。现用现配（或冰箱保存不超过两周）。6、10%SDS：称取5g SDS溶于50ml三蒸水中，室温保存。7、考马斯亮蓝染色液：0.25%考马斯亮蓝R-250，50%甲醇，7%冰乙酸称取1.25g考马斯亮蓝R-250，加入250ml甲醇，35ml冰乙酸，补充蒸馏水至500ml，滤纸过滤后置棕色瓶中保存，可重复使用。8、考马斯亮蓝脱色液：30%甲醇，7%冰乙酸。（或：甲醇：冰乙酸：ddH2O=3:1:6）9、TBST（tri
9、s buffer solution with tween-20）：20mmol/L Tris-Cl（pH7.5），500mmol/L NaCl，0.05%tween-20。称取Tris碱1.21g，NaCl 14.6g，将其溶于500ml蒸馏水中，加入610滴浓盐酸，调pH到7.5左右，加入250l tween-20。10、转移缓冲液：39mM甘氨酸，48mM Tris碱，0.037%SDS，20%甲醇称取1.46g甘氨酸，2.9g Tris碱，0.185g SDS，将其溶于400ml三蒸水中，加入100ml甲醇。11、封闭液：5%脱脂奶粉或1%BSA（用TBS配制）。现用现配。12、抗体稀释液：用TBS配制(亦可用PBS)。现用现配。