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1、青霉素的合成 专业：制药工程年级：091班姓名：刘卫丽学号：20090934129青霉素的合成摘要：青霉素是抗菌素的一种,是从青霉菌培养液中提制的药物,是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素的出现开创了用抗生素治疗疾病的新纪元。通过数十年的完善，青霉素针剂和口服青霉素已能分别治疗肺炎、肺结核、脑膜炎、心内膜炎、白喉、炭疽等病。基于它的抗菌原理及药理青霉素的应用不断增加。随着其应用的增加，其工艺流程也益加完善。青霉素是人类发现的第一种毒性很小又能有效杀菌的抗生素。从其发现到量产经历了十四年。自1940年青霉素投入使用以来，该类抗生素以其疗效确切、对人体细胞毒性小及价格低廉而广泛应用。目前，青霉
2、素类抗生素已从抗阳性窄谱品种发展到广谱品种。主要由制药企业大规模生产如：甲氧西林、如美西林、阿莫西林、阿扑西林等。抗菌作用原理青霉素抗菌作用原理：革兰氏阳性菌细胞壁主要由粘肽构成下，才能交互联结形成网络状结构包绕着整个细菌，青霉素的化学结构与合成粘肽的前体物的结构部分相似，竞争地与转肽酶结合，使该酶的活性降低，粘肽合成发生障碍，造成细胞壁缺损，导致菌体死亡。 青霉素的药理青霉素是B-内酰胺抗生素，在细胞繁殖期起杀菌作用。青霉素药理作用是干扰细菌细胞壁的合成。青霉素的结构与细胞壁的成分粘肽结构中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的
3、渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 青霉素的药效 氯霉素是具广谱抗菌作用，对革兰阴性菌的作用较革兰阳性菌强，对伤寒杆菌、流感杆菌和百日咳杆菌的作用比其他抗生素强，对立克次体感染（如斑疹伤寒）以及病毒感染（如沙眼）均有较好作用。对布氏杆菌、大肠杆菌、产气杆菌、肺炎杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、脑膜炎双球菌、淋球菌等也有较强抗菌作用。本品属抑菌剂，其作用机理主要抑制细菌蛋白质的合成，系作用于核糖核蛋白体的50S亚基上，抑制肽基转移酶的作用，阻止了肽链的增长。临床上主要用于伤寒、副伤寒和其他沙门氏菌感染，疗效好，目前仍是治疗这些疾病的首选药物。此外，对脑膜炎双球菌、肺炎球菌、流感杆菌、链球菌等引起的脑膜炎及
4、其他感染也有较好作用。也可用于百日咳、布氏杆菌病、立克次体病等。青霉素类溶液的稳定性青霉素类在干燥状态下相对稳定，遇湿即加速分解。青霉素类在水溶液中甚不稳定，放置时间越长则分解越多，不仅药效消失，而且产生的致敏物质也增多。所以，青霉素类药物，宜在临用前方进行溶解配制，以保证疗效和减少不良反应发生。青霉素类在近中性（PH67）溶液中较为稳定，酸性或碱性增强，均可使之加速分解。应用时最好用注射用水或等渗氯化钠注射液溶解青霉素类。溶于葡萄糖液中可有一定程度的分解。苯唑西林等异噁唑青霉素有耐酸性质，在葡萄糖液中稳定。青霉素类在碱性溶液中分解极快。因此，严禁将碱性药液（碳酸氢钠、氨茶碱等）与其配伍。青霉
5、素类药物系杀菌性抗生素，只在细胞分裂后期细胞壁形成的短时间内有效。它们的杀菌疗效主要取决于血药浓度的高低，在短时间内有较高的血药浓度时对治疗有利。若采取滴注给药，宜将一次剂量的药物溶于约100ml输液中，于0.51小时内滴完。一则可在较短时间内达到较高的血药浓度，二则可减少药物分解并产生致敏物质。把青霉素类溶于较多量输液中缓慢滴注的方法已趋向少用。 青霉素的发酵工艺过程 1、工艺流程 （1）丝状菌三级发酵工艺流程 冷冻管（25C，孢子培养，7天）斜面母瓶（25C，孢子培养，7天）大米孢子（26C，种子培养56h,1:1.5vvm）一级种子培养液（27C，种子培养，24h,1:1.5vvm）二级
6、种子培养液（2726C,发酵,7天,1:0.95vvm）发酵液。 （2）球状菌二级发酵工艺流程 冷冻管（25C，孢子培养，68天） 亲米（25C，孢子培养，810天）生产米（28C，孢子培养5660h,1:1.5vvm）种子培养液（2625-24C，发酵，7天，1：0.8vvm）发酵液。2、工艺控制 （1）影响发酵产率的因素 基质浓度 在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制 , 苯乙酸的生长抑制）, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成 , 为了避免这一现象 , 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法 , 即对
7、容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加 , 因为即使是超出最适浓度范围较小的波动 , 都将引起严重的阻遏或限制 , 使生物合成速度减慢或停止。目前 , 糖浓度的检测尚难在线进 行 , 故葡萄糖的流加不是依据糖浓度控制 , 而是间接根据pH 值、溶氧或 C02 释放率予以调节。 （2）温度 青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别 , 但一般认为应在25 C 左右。温度过高将明显降低发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者,
8、 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。 （3） pH 值 青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 , 有时也可以略高或略低一些 , 但应尽量避免 pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH 值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使 pH 值降低； 过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起 pH 值上升。 （4）溶氧 对于好氧的青霉素发酵来说 , 溶氧浓度是影响发酵
9、过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于 10% 饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高 , 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。 （5）菌丝浓度 发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度 (取决于维持因数的大小, 维持因数越大,呼吸强度越高) 、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质
10、而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。 （6）菌丝生长速度 用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于 O. 015h-1时, 比生产速率与比生长速率无关 D 因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率, 必须使比生长速率不低0.015h-1 。这一比生长速率称为 临界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说, 维持0.015h斗的临界比生长速
11、率意味着每 46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现的。事实上 , 青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然能达到很高的比生产速率。这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要高一些。 3、工艺控制要点（1）种子质量的控制 丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25 C 培养 7 天, 真空干燥并以这种形式保存备用。生产时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内 ,26 C 培养 56h
12、左右, 菌丝浓度达6%-8%, 菌丝形态正常, 按 10%-15%的接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内,27C 培养 24h, 菌丝体积 10%-12%, 形态正常, 效价在700D/ml左右便可作为发酵种子。 球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有O. 5% -1. 0 %玉米浆的三角瓶培养原始亲米孢子, 然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子 (又称生产米), 亲米和生产米均为25 C静置培养, 需经常观察生长发育情况在培养到 3-4 天, 大米表面长出明显小集落时要振摇均匀, 使菌丝在大米表面能均匀生长, 待10 天左右形成绿色孢子即可收获。亲米成熟接人生产米后也要经过激烈振荡才
13、可放置恒温培养, 生产米的孢子量要求每粒米300万只以上。亲米、生产米子孢子都需保存在 5 C冰箱内。 工艺要求将新鲜的生产米 (指收获后的孢瓶在10天以内使用) 接人含有花生饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主的种子罐内,28 C 培养 50-60h当pH 值由6. 0-6. 5 下降至 5.5-5. 0, 菌丝呈菊花团状,平均直径在 100- 130m, 每毫升的球数为 6万 -8万只, 沉降率在 85% 以上, 即可根据发酵罐球数控制在 8000-11000只/ml 范围的要求, 计算移种体积, 然后接入发酵罐, 多余的种子液弃去。球状菌以新鲜孢子为佳, 其生产水平优于真空干燥的孢子，能使
14、青霉素发酵单位的罐批差异减少。 （2）培养基成分的控制a. 碳源 产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生产上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液 (DE 值 50% 以上) 进行流加。 b. 氮源 氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。c. 前体 生物合成含有苄基基团的青霉素 G, 需在发酵液中加人前体。前体可用苯乙酸、苯乙酰胺, 一次加入量不大于0.1%, 并采用多次加入, 以防止前体对青霉素的毒害。 d. 无机盐加人的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等, 且用量要适度。另外, 由于铁离子对青霉菌有毒害作用, 必须严格控制铁离子的浓度, 一般控制在3
15、0 g/ml （3）发酵培养的控制a. 加糖控制 加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的 pH 值确定 , 最好是根据排气中CO2 量及 O2 量来控制, 一般在残糖降至 0.6% 左右, pH 值上升时开始加糖。 b. 补氮及加前体 补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素, 使发酵液氨氮控制在 O. 01%-0.05%,补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为 0.05%-0.08% 。 c. pH 值控制 对pH 值的要求视不同菌种而异, 一般为 pH 6.4-6.8, 可以补加葡萄 糖来控制。目前一般采用加酸或加碱控制pH值。 d. 温度控制 前期 2 5- 2 6 C, 后期 23 C, 以减少后期
16、发酵液中青霉素的降解破坏。e. 溶解氧的控制 一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的30% 。通风比一般为1 : 0. 8L/(L min), 搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。 f. 泡沫的控制 在发酵过程中产生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂 泡敌 来消泡, 应当控制其用量并要少量多次加入, 尤其在发酵前期不宜多用, 否则会影响菌体的呼吸代谢。参考文献：吴晓英 生物制药工艺学 北京：化学化工出版社 2009郭勇 生物制药技术 第二版 北京：中国轻工业出版社 2007熊宗贵 发酵工艺原理 北京：中国医药科技出版社 1995何建勇 生物制药工艺学 北京：人民卫生出版社 2007吴梧桐 生物技术药物学 北京：高高等教育出版社 2003梁世中 生物制药理论与实践 北京：化学化工出版社 2005