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1、微生物复习提纲一、 常用培养基的制备、消毒1、 培养基的分类P902、 培养基配制P211（1）计算 根据配方计算出实验中各种药品所需要的量，然后再分别称量。（2）称量 准确称取各种成分。一些不易称量的成分如牛肉膏，可用玻璃棒取出放称量纸（或小烧杯）称量。（3）溶解 向烧杯内加入合适的水量，将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠等用水洗下后加热搅拌至全溶后，再加入琼脂进行溶解，最后补足水量。（4）调pH值 用酸度计或精密pH试纸测定其pH值，并用NaOH或HCl标准溶液调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。（5）分装 根据不同需要，可将配好的培
2、养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。（6）包扎 试管扎成捆。试管和三角瓶的棉塞外用硫酸纸或牛皮纸包扎，纸上标明培养基的名称、配制日期等。（7）灭菌 培养基用0.1Mpa（121摄氏度）高压蒸汽灭菌1520min。3、消毒（高压蒸汽灭菌锅使用）灭菌方法：1、加水于灭菌器内到规定的水平面。2、需灭菌的物品（分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基），棉塞、硅胶泡沫塞等用防潮纸包好（防止锅内水汽把棉塞淋湿），放入灭菌锅内的套筒中。摆放要疏松，
3、不可太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果。3、将灭菌锅盖旋转，使锅盖向下紧压锅体，切勿漏气。4、设定灭菌温度和时间：121摄氏度，20分钟；5、打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气，当温度到达100摄氏度左右，关闭放气阀。6、关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压力和温度都上升，直至压力表指针达到所需压力时，温度达到121摄氏度，灭菌开始计时，通过调节热源，维持此压力到所需时间。7、灭菌完毕，待压力自然降至0时，打开放气阀，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。8、打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。9、灭
4、菌锅用完后，将锅内剩余的水倒掉，以免日久产生水垢。二、其他灭菌和消毒方法P104消毒：是用物理、化学或生物的方法杀死病原微生物的过程。灭菌：是指杀灭物体中或物体上的所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）的繁殖体和芽孢的过程。灭菌的方法分为物理灭菌法和化学灭菌法。物理方法：（1） 干热灭菌法灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物尸体等的灭菌。干热空气灭菌法：把待灭菌的物品均匀的放入烘箱中，150170，恒温12小时即可。此法适用于玻璃器皿、金属用具等的消毒。（2） 湿热灭菌法在相同的温度
5、下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好。这是因为，细胞内蛋白质含水量高，容易变性；高温水蒸气对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。巴氏消毒法：既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。主要有两种方法：第一种是在63下，30分钟消毒；第二种是在75下保持15秒。煮沸消毒法：直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌的全部营养细胞和部分芽孢。间歇灭菌法：将待灭菌的物品加热至80100，1530分钟，杀死其中的营养体。然后冷却，放入37 恒温箱中过夜，然残留的芽孢萌发成营养体。第2天再重复以上步骤，如此进行3次左右，就可以达到灭菌的目的。高压蒸汽灭菌法：实验室最常用
6、的一种方法。是把待灭菌的物品放在一个可密闭的高压蒸汽灭菌锅内进行，以大量蒸汽使其中压力升高。在蒸汽压力达到103.4KPA时，水蒸气的温度可达到121 ，微生物（包括芽孢）在1520分钟内便会被杀死，而达到灭菌的目的。化学方法：一般化学药剂无法杀死所有的微生物，只能杀死其中的病原微生物，只能其消毒剂的作用。能迅速杀灭病原微生物的药物，称为消毒剂；能抑制或阻止微生物生长繁殖的药物，称为防腐剂。常见的有酸、碱、盐、氧化剂、其他有机物等。三、无菌操作技术培养基经过高压蒸汽灭菌后，用经过灭菌的工具，在无菌条件下，移接含菌材料于培养基上的过程。斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管
7、口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞注意：无菌操作注意事项！四、食品中菌落总数的测定（GB4789.2-2010）是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中形成的细菌菌落总数。以 CFU/g（mL）来表示。操作步骤： (一)取样、稀释和培养 1、以无菌操作取检样25g（mL），放于225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。 固体和半固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以800010000r/min的速度处理12min，制成1:10的均匀稀释液。 液体样品以无菌吸管
8、吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 （瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。2、用1 mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内（注意吸管或吸管尖端不要触及稀释液面），振摇试管,混合均匀，制成1:100的稀释液。 3、另取1 mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1 mL吸管。4、根据标准要求或对污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀
9、释度做两个平皿。同时，分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。5、稀释液移入平皿后，将冷却至46琼脂培养基注入平皿约1520ml，并转动平皿，混合均匀。 6、待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养482h。7、培养结束后，进行菌落计数，得出实验报告。计数规则：选取菌落数在 30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到
10、平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。结果与报告：若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算:式中：N样品中菌落数C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n 1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n 2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU
11、，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU300 CFU 之间，其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时，则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。菌落数小于 100 CFU 时，按四舍五入原则修约，以整数报告。菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用四舍五
12、入原则修约后，取前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按四舍五入原则修约后，采用两位有效数字。 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。五、食品中大肠菌群的测定（GB4789.3-2010）大肠菌群指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。第一法 大肠菌群 MPN 计数法操作步骤：7.1 样品的稀释7.1.1 固体和半固体样品:称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内 ,8
13、000r/min10000r/min均质1min2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min2min,制成110的样品匀液。7.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成110的样品匀液。7.1.3 样品匀液的pH 应在6.57.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH 或1mol/LHCl调节。7.1.4 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取110样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理
14、盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1100的样品匀液。7.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。7.2 初发酵试验每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤),36 1 培养24h2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h2h产气者进行复发酵
15、试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。7.3 复发酵试验(证实试验)用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中, 361培养48h2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。7.4 大肠菌群最可能数(MPN)的报告按7.3确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索 MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。第二法 大肠菌群平板计数法7 检验程序大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。8 操作步骤8.1 样品的稀释按6.1进行。8.2 平板计数8.2.1 选取2个3个适宜的连续
16、稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。8.2.2 及时将15 mL20 mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 1 培养18 h24 h。8.3 平板菌落数的选择选取菌落数在 15 CFU150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5 mm 或更大。8.4 证实试验从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类
17、型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36 1 培养 24 h48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。8.5 大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g （mL）样品中大肠菌群数。例：10-4 样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取 其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105 CFU/g（mL）。六、补充1、食品相关法律法规：食品安全法：2015年10月1日正式实施健康证有效期
18、一年2、实验中操作问题讨论：1.培养基灭菌后，需要冷却到45 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以将培养基加热后置于46摄氏度恒温水浴锅中保温，也可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。