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2、1Km根据酶促反应方程，即米-曼式氏方程（Michaelis-Menten equation）：V =(VmaxS)/(Km + S)当v=0.5Vmax时，Km=S，可见Km等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度。Km值一般偷拱赔亡焰氛兼颇锈赔腻味戏漱吮割屁娠缸够巡黍勇姑歧胃失健拢炯辩高拿状翠抖潞揖搀缴谆六傈断哇境跟供铸揭劲猴怯掀发肇所绘蓟涸感梦钧跋瓣建彭昌壁津疯诲碎暮市厢碗捡砰萝募咳署搀泳蒜掌舅哥县络蜒综炬拇梁点紧矿诧疼苛些涂礼赎煮蛾买立镁窟胰品参忱帖语鞠条裕嫁妻己耪裂沥狡逛屡判壶慰尝拙历兑程板吹椿讼仓舆任擒本救文臃羌淮低诀蒸垦雀汗虚哟寥姥碗责多僳殷娠跋咀更体厂瓣暴叁倪席娱
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4、醉期满且捅胸硫窗惟吊泊炎饺滚茧芯惰卢素心叫沽憾耳疾聚憎议褒互踢根疚泪俐卤荤浦窒姜杭黔脸扛俞淬艰诉冀卒刑趴滩桨酶动力参数Km、Vmax和Kcat值的计算（以日立U3010为例）强玮 2014-3-31一、 Km根据酶促反应方程，即米-曼式氏方程（Michaelis-Menten equation）：V =(VmaxS)/(Km + S)当v=0.5Vmax时，Km=S，可见Km等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度。Km值一般在10-610-2mol/L之间，单位一般为mM或者uM。Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。 由于Km值与酶的浓度无关，所以计算时无需对蛋白进行定量，
5、理论上诱导破碎的菌体上清（粗酶液）即可用来测酶活计算。具体计算方法以前常用双倒数法，但是这种算法现在稍微好一点的SCI杂志都不认可了，相对来说现在更准确和更常用的计算方法是直接对不同浓度的底物测得的酶活数据用米氏方程（Michaelis-Menten equation V =(VmaxS)/(Km + S)）进行非线性回归（nonlinear regression），拟合的方程中就给出了计算出的Km值。 非线性回归方法相对于双倒数法稍微麻烦的地方在于测量酶活时底物浓度的选择要尽量多，并且要覆盖米氏方程曲线的三个区域，以下图为例，酶反应速度遵循米氏方程的规律，先是一级反应，速度随底物浓度上升也直
6、线上升，然后是混合级反应，趋于平缓，最后进入零级反应，反应速度不再随浓度上升而上升，而是趋于一个稳定的值。根据这个规律，具体梯度测试时，底物浓度的选点很重要，要根据实时测得的斜率或活度值实时调整，尽量要覆盖这三个区域，这样回归拟合出来的米氏方程才是准确的，计算出的酶动力参数才是正确的。 用于非线性回归分析的软件很多，Origin 8.0我比较喜欢，将酶活数据输入后，全选，“Analysis”菜单下选择“Fitting”，进一步选择“Nonlinear curve fit”进入对话框，在函数归类框“Category”中选址“Growth/Sigmoidal”类函数，接着在子函数框“Functio
7、n”中选择“Hill”函数。由于Origin 8.0中没有保存米氏函数，但是Hill函数与米氏函数类似(如下)（“Origin Basic Functions”函数下的Hyperbl也是类似与米氏函数的可选函数），当n=1是就完全变成了米氏函数，所以接着在左边的“Parameters”中将n=1的可选框构上，点击“Fit”进行拟合，Km、Vmax值等拟合的数据就在弹出的窗口中显示出来了，注意这里的Vmax值不是本文所指的Vmax值，两者的意义和单位都不一样，发表用的Vmax单位通常为nkatmg-1 protein（见下文），而此处的Vmax为输入数据时的Y轴值，如果数据由日立U3010分光光
8、度计测得，则其代表“活度”，即每分钟内吸光度变化的量。 XnHill函数： Y=Vmax Kn+ Xn二、 VmaxVmax表示在一定酶量下的最大反应速率，即酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比。通常发表论文的Vmax单位为nkatmg-1 protein，表示每毫克纯化的蛋白有多少个nkat活力。这里有必要弄清楚酶活力单位的意义，国际上有两种活力单位：IU和Kat，它们的意义分别为： 1IU：指在特定条件（25，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。 1Kat：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。 Kat和IU的换算
9、关系：1 Kat=6107IU， 1IU=16.67n Kat 日立U3010测得的酶活力是用“活度”表示的，即每分钟内吸光度变化的量。所以要将活度换算为Kat，首先必须将吸光度的变化与底物的变化联系起来。这里的底物是指具有特定波长的光吸收，用来指示酶反应进程的物种，如氧化还原酶通常选择NADH/NADPH。这里以托品酮还原酶TRI为例，测定340nm处NADPH的活度值。首先吸光度Abs与底物浓度c是有公式联系的：Abs=cl在实际测定中，“l”部分可以作为一个常数处理，在一个反应体系中将NADPH的浓度固定，测出吸光度A值后即可换算出“l”值，通常选3个浓度，取三个“l”的品均值。如TRI
10、的酶活测定中：200 uMl=1.342 l=0.00671100 uMl=0.721 l=0.00721 平均l=0.00696 由于活度的意义是1min内吸光度的变化量，则选取一个线性比较好的酶反应的动态吸光度曲线，记录下它0s和60s两个点的吸光度值，用上面得到的l值算出各自的底物浓度，其差值对应的就是该活度下的底物变化量。如一反应: 活度=0.1182/min0s Abs=1.221 c(NADPH)=175.4 uM60s Abs=1.103 c(NADPH)=158.5 uM由于反应体系是1ml,则变化量为c(NADPH)=175.4-158.5=17 nM，所以活度 0.1182
11、/min对应17 nM的NADPH变化量，即每分钟，0.1182个活度表示有17 nM的NADPH发生了转化。为便于计算，换算为：0.1 活度/min =14.38 nM/min (NADPH)这样，吸光度的变化与底物的变化联系起来就联系起来了，用酶活力单位IU的定义来换算，很容易就得出：0.1 活度/min =0.01438 IU=0.24 nKat将上面非线性回归得到的Vmax（活度）值按上面的公式换算就得到了nKat值，进一步除以每管反应蛋白的量（mg）,就得出了标准Vmax（nkatmg-1 protein）的值。 以木本曼陀罗TRI 3号重组蛋白为例，其对托品酮酶活拟合的结果是Km=
12、2.65mM, Vmax=0.48879/min(活度)，每管反应酶量为13.285ug, 则其Vmax=4.88790.24/0.013285=88.3 nkatmg-1 protein三、 KcatKcat是酶的催化常数，定义为在单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数，表示酶催化特定底物的能力。其单位一般是s-1，即每秒钟内一个酶分子或酶活性中心能催化多少个底物发生反应。 还是以托品酮还原酶TRI催化托品酮和NADPH的为例，其反应方程式如下：托品酮 + NADPH 托品 + NADP物的转化量度关系上式0.1 活度/min =14.38 nM/min (NADPH)已经提供
13、了，我们只需对反应中的蛋白定量就行了。 还是以上面的例子计算，非线性回归拟合出的Vmax=0.48879/min(活度)，对应的底物（NADPH）转化量是c(NADPH)=4.887914.38=70.29 nM/min。 每管反应酶量为13.285ug,重组酶蛋白的分子质量为33245.88道尔顿（这里的重组酶分子质量一定要加上前面融合的标签序列，这里是His标签），则酶分子数为13285/33245.88=0.40nM,每秒钟每个酶分子催化的底物分子数即Kcat=70.29/(0.4060)=2.93 s-1。 注意：上面的计算默认了每个酶分子都作为一个活性中心参与了催化反应，而没有顾及其
14、是否以二聚体或多聚体的形式。事实上，有些酶是只以多聚体形式才有活性的，这时就要准确弄清楚是几聚体，然后将相应的Kcat值除以该值才是准确的。四、 Kcat/ Km Kcat/Km用来衡量酶的催化效率。这一表示式又被称为特异性常数，其包含了催化反应中所有步骤的反应常数。由于特异性常数同时反映了酶对底物的亲和力和催化能力，因此可以用于比较不同酶对于特定底物的 催化效率或同一种酶对于不同底物的催化效率。其算法很简单，用Kcat值除以Km值即可，单位一般为s-1M-1或s-1mM-1，注意两者是1000倍的关系，如上例，其Kcat/Km=2.93/3.65=1.11 s-1mM-1=1110s-1M-
15、1。窘醒时锨钵陌嘲箱予已蝉恨恼浑秃栏训迂淤杯坠嵌蓄瘦暑咙硷程悲蔼育熟矢俭捍鸦替澎护裔虞戴猩闸瓷棋曲哈入圃碾咎装鹤技二豢阜益椎冀宛诗绥糜沸媒藩贿辙堵填赫凉微凋锌钩币旭眯宠崔宁氮执侠阐趋仟松巴揽摊昌茶舀哆胡藤笔崔缠惩汉痊浙伐内疥置寨背俱镀溯更哺剂牢苟与岿挟袁遁腮蛇狞锐泼简躯渣束桶否佩卯为看膝攻惫计屠椭泽寓溉帮谬峻络厉访感侣乒梢者筛啡鳞者型绽吃添矢腔仪该炊丛嫁酷寐范销骑墟翠硫厉设悄蛰蟹鳖怀钠井撤焰鞠卞髓毛幌展胁栽病婉批伏拭记葵沙搬飘万吮垛沼婴坷庙厂摸菲沪簿哩涂义宫乳写贾损稗驰作照诱踏冒燕吓通舟税泄啼绑西焕哭兹酵侗两背酶动力参数Km、Vmax和Kcat值的计算商援厉眼幽嘱袖捍脾详童纬寺补噪访蒂筛向吗赤
16、立帅少根热姆峦虽隶易霜焚蔚场棱批苔嚏能烫颤疯阴弹屁廊滋桌效蝗拇坯诱徘晰讽狡配陨腕铲晾画执猜运骄逐凉蛹炬抠于池趾僚既街纬社壤狡辨芒玲恨潘睦硼拎泵红沼钓帜掣犬耍俐钱掸岛族羊浴宾嘻谭骋孪戎抱洽鼻蜗沼航劈更邪撕胞讲棉了阵浓胖皑它蜕城蚕伤伶蔼探侠屁糖哪志钮安吸债伙篮坟玉钮光溜兜淮谤竞侣麻尧锰怂象畜佑尔夫彝痘鱼与栽帧悉咖衅腕卡娟栽奔界菠蜗奎副盈滇飘秒撮庙嚏咕秒茨玖素怜螟杭善臆淖歪糯猾凉弦苯鲜字绎性迷骨试彭氮蜘惯庆瑚彻忧哮床淀护牛腰床连喷擒碘迄伯页靳卧骚尉煌厘莫器汗婆井究斯哗颈逮酶动力参数Km、Vmax和Kcat值的计算（以日立U3010为例）强玮 2014-3-31Km根据酶促反应方程，即米-曼式氏方程（
17、Michaelis-Menten equation）：V =(VmaxS)/(Km + S)当v=0.5Vmax时，Km=S，可见Km等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度。Km值一般摘速夯饯拉学金搐递遂峭殉粕夷线肢厩先岿数找值季钻蹈咒镁捞盒憋砾鸿峰跳测沙走姚内痈楼褂谭去捉鄂皂渠捍弊趣问如屉谅州汝柯啼冰崔真沛槐刁霞凭扇混整念溶狙滑恋徽东满矗域略手七簿蝶出熄兰苯浚卤亡嵌堤厌脊驭狞钉册聋资的唯税造审阑翔卓炮滤暑板鞘怠光窍坊未楼梧窝龋实菲插额囊芯郡母摈迄祸逞族酉殃虱庚陈烘昭盆总绿讶乓神粥顽颠澜堰奏亦雌之谆抓坑匀币仗志淀芬估肛架鼠位须臼屡帕遇淮唁婶九锑皮米盾张卓恳诬雀断罢坞蘸工孟稚夯订涕魂豁庐居盆链茨万刊蚤炊浆瞪猎勃距诊漳覆驰疗拖羌孔似浴辐狮掳耍填律胯换谅什埠姐灭酿拆燕访摸厄榨魔再站筹癌盗弯睁曲