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1、外源性p21waf1基因转染对人胃癌细胞系的识别分析3500字 p21waf1为野生型p53激活片段（wild-type p53 activated fragment 1，WAF1），它为单拷贝基因，是一种非常重要的抑癌基因，也是目前研究热点1。它作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）家族成员，是细胞周期蛋白（cyclin）与细胞周期蛋白依赖激酶（CDKs）的广泛抑制剂，主要参与细胞周期调控2。已有研究证实，p21waf1基因突变或缺失与胃癌、食管癌、膀胱癌、乳腺癌、胆管癌等恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关，以及通过改变p21waf1基因的表达可以起到调节肿瘤生长的作用3-5。因此，本研
2、究将外源性p21waf1基因转染到人胃癌细胞系BGC-823中，使其稳定表达后，来研究其对人胃癌细胞增殖的影响。1材料与方法1.1实验材料pIRES-p21waf1真核表达载体、人胃癌细胞系BGC-823（由青岛大学医学院附属医院中心实验室构建并惠赠），基因转染试剂盒（QIAGEN公司），Trizol试剂、DMEM-高糖培养基（Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（Takara公司），p21waf1及3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物及各自Taqman探针（由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供），鼠抗人p21waf1单克隆抗体（Santa Cruz公司），兔抗鼠二抗、四甲基偶氮
3、唑蓝（MTT）（QIAGEN公司）。 /1.2细胞培养方法人胃癌细胞系BGC-823培养条件为含10胎牛血清的DMEM-高糖完全培养液，37 、5CO2饱和湿度孵箱中孵育。倒置相差显微镜观察细胞形态，取对数生长期细胞进行相关实验。1.3基因转染条件和方法参照QIAGEN转染试剂盒说明书进行。采用24孔板转染细胞，分三个组，分别为pIRES-p21waf1转染组、pIRES-neo空载体组、未转染组。1.4p21waf1 mRNA表达的检测依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，按照Trizol试剂盒说明提取总RNA。p21waf1基因引物设计：上游：5&rsquo
4、;-GGACAGCAGAGCACC1.5p21waf1蛋白表达的检测依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，提取细胞总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，进行一抗（鼠抗人p21单克隆抗体）、二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗）孵育和显色，曝光并照相。使用HPIAS-1000型全自动图像分析仪分析蛋白条带灰度值。1.6细胞增殖能力的检测各组均取对数生长期的细胞，采用经典的MTT法检测后，绘制细胞生长曲线，分析各组细胞的增殖能力。1.7细胞周期分布的检测依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，各约1x106个细胞，加入终浓度7
5、0冷乙醇，4 固定24 h，PBS洗涤离心三遍，加入Rnase酶（2 mg/ml）于37 水浴30 min，再加碘化丙啶（25 mg/ml）染色，4 避光20 min，经尼龙网滤过后，上流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况。1.8统计学处理采用SPSS 13.0统计软件包进行处理，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t 检验，计数资料采用 字2检验，以P0.05）。各组p21waf1蛋白表达见图3。3讨论据众多研究表明，细胞周期失去控制是肿瘤细胞恶性增殖重要原因之一6。Cyclin-CDKs-CKI共同构成了细胞增殖的内源性调控系统，其中Cyclin对CDKs有正性调控作用，C
6、KI则起负性调控作用。Cyclins与其相对应CDKs结合成cyclins-CDKs复合物后可以起到激活CDKs作用，对特定底物磷酸化，从而促进细胞周期演变、启动DNA的合成、促进细胞分裂等重要功能7。p21waf1作为一种重要的CKI，可与多种cyclins-CDKs复合物结合（如CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2、CyclinD-CDK4等）并抑制CDKs对特定底物的磷酸化作用。另一方面，p21waf1的C端还是DNA复制必需因子-增殖细胞核抗原（PCNA）结合域，其与PCNA结合后，阻碍其与DNA聚合酶结合成全酶复合物，从而在DNA复制过程中，阻止了全酶复合物在DNA单链
7、上的滑动，使DNA得复制不能继续进行8。p21通过结合并起到对CDKs和PCNA的双重抑制，最终均导致细胞在增殖过程中，停滞在细胞周期G1/S关键点，并诱导细胞凋亡，进而抑制了细胞的继续无限增殖周期8。本研究将外源性p21waf1基因转染人胃癌细胞系BGC-823中后，p21waf1转染细胞组，p21waf1mRNA和p21waf1蛋白均高表达；p21waf1转染组BGC-823细胞生长速度低于空载体组和未转染组；流式细胞仪观察到p21waf1蛋白高表达使BGC-823细胞发生G1/S阻滞，G1期细胞数目明显要多于空载体组和未转染组，而S期细胞数则明显要低于空载体组和未转染组，并出现凋亡峰。笔
8、者认为，外源性p21waf1基因转染且稳定表达后，可能通过p21waf1-cyclins-CDKs途径，起到对CDKs和PCNA的活性的双重抑制，进而使癌细胞DNA合成及细胞周期演进受阻，最终导致癌细胞增殖活性明显降低，大量停滞于G1期。根据本文结果，笔者认为，外源性p21waf1基因转染可以抑制人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖和促进细胞凋亡，将来可能为研究胃癌的治疗方法提供一条新的思路。参考文献1 张志平，王洲，刘相燕，等.RNA激活上调p21waf1/CIP1基因表达对胃癌细胞增殖和凋亡影响的研究J.中华肿瘤防治杂志，2011，18（14）：1080-1083.2 Gartel，A L，
9、Tyner，A L.The role of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 in ApoptosisJ.Mol Cancer Ther，2002，（1）1:639-649.3 张学彦，景德怀，刘志强，等.p21waf1基因对人食管鳞癌细胞增殖的抑制作用J.世界华人消化杂志，2009，17（14）：1384-1389. /4 刘卫梅.p21在食管癌组织中的表达及临床意义J.肿瘤基础与临床，2007，20（2）：173-174.5 王贵英，王士杰，李勇，等.细胞周期调控因子与癌发生的关系J.国外医学:肿瘤学分册，2005，32（1）：14-16.
10、6 Shapiro，G I.Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatmentJ.J Clin Onco1，2006，24（1）：1770-1783.7 Chen J，Jackson P K，Kirschner M W，et al.Separate domains of p21 involved in the inhibition of Cdk kinase and PCNAJ.Nature，1995，374（1）：386-388.8 Yang K，Zheng X Y，Qin J，et a1.Up-regulation of p21WAF1/Ciplby saRNA induces G1-phase arrest and apoptosis in T24 human bladder cancer cellsJ.Cancer Lett，2008，265（1）：206-214. /