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1、大黄煎剂治疗轻微型肝性脑病患者的作用机制(2)2. 2 观察指标和方法。采用 GC-TOFMS （ 购自美国 Pegasus HTLECO公司） 和 UPLC-QTOFMS （ 购自美国 Waters 公司）仪器观察两组患者治疗前后血清代谢谱的变化。2. 2. 1 采样情况 两组患者治疗前后于早晨空腹抽血，室温下静置至其自然凝结后进行离心，3000 r / min 离心 10 min,取上清液置于 - 80 冰箱冻存备用。2. 2. 2 样本制备 UPLC-QTOFMS 样本制备： 取解冻后的样本，混旋均匀，精密吸取 40μl 于1. 5 ml 的离心管中，加入 0. 3 mg / ml
2、 的氯苯丙氨酸（ 批号： 31096CK,购自美国 Sigma 公司） 水溶液20 μl,再加 入 60 μl 水 后， 加 入 于 4 放 置 过30 min 的萃取溶剂甲醇 乙腈 （ 1 9 ） 500 μl（ 甲醇批号： I667707251,购自德国 Merck 公司；乙腈批号： 145760,购自美国 Fisher 公司） ,混旋2 min,超声 1 min.于 - 20 放置 10 min 后，于412 000 r / min 离心 15 min,取上清液各 150 μl 于玻璃进样瓶中的内插管， -80冻存。GC-TOFMS 样本制备： 血清溶解，涡旋混匀
3、后移取 100μl,加入甲醇溶解的 1mg/ml 十七酸 （ 批号： 026K1543,购自美国 Sigma 公司） 10μl 和水溶解的0. 3mg/ml 氯苯丙氨酸10μl,混匀后加入混合溶剂 300μl （ 氯仿 甲醇 1 3） （ 氯仿批号：K31N56,购自美国 J. T. BAKER 公司） 涡旋混匀，- 20 静 置 10 min,4 离 心 10 min （ 10 000 r /min） .取 300 μl 上清液于 1. 5 ml 高回收进样瓶中，室温下真空干燥。抽干后用氮气对样品再次干燥，以保证样品中无水并排除空气中湿气对衍生的影响（ 衍 生
4、时，空 气 湿 度 35%） .氮 气 吹 干 后 加 入15 mg / ml 吡啶 （ 批号： SZABD148SV, 购自美国Sigma 公司） 溶解的甲氧胺 （ 批号： BCBN2932V,购自美国 Sigma 公司） 80μl,密封后振荡 30s,30 摇床 （ 220 r / min） 反应 90 min; 反应结束后，在反应瓶中加入 80μl 的 BSFTA （ 含 1% TMCS,批号： LC08598V,购自美国 Sigma 公司） ,密封后振荡 30s,70反应 60min.反应结束后，振荡 10s,室温下放置 1h 后进样分析。2. 3 统计学分析。所有样本均采
5、用 GC-TOFMS 和 UPLC-QTOFMS两个互补平台进行检测，分别采用混合样本质控进行原始数据校正，校正后的数据合并后进行主成分分析 （ PCA） 和偏最小二乘法判别分析 （ OPLS-DA） 等多维统计分析，组间差异的显着性分析采用 t 检验，显着性程度指标 P 值控制在 0. 05 之内。数据处理及分析过程中用到的软件主要有： SPSS15. 0、SIMCA-P + 12. 0. 1 （ Umetrics,Ume，Swe-den） 、Excel 2007 （ Microsoft,USA） 等。3 结果。通过分析 GC-TOFMS 和 UPLC-QTOFMS 平台所得到数据，在血清中
6、鉴定了 246 个物质，所有多维统计均采用这些物质进行分析。对大黄煎剂组和安慰剂组进行 PCA 和 OPLS-DA 建模分析。PCA 分析结果： 图 1 可以看出，MHE 患者使用大黄煎剂治疗前后血清代谢轮廓的分组趋势不明显，有较多重叠，表明 MHE 患者在大黄煎剂治疗前后其内源性代谢产物变化不明显。图 1 大黄煎剂组对应的模型参数 R2X = 0. 393,表示该模型能解释因变量 39. 3%的变异信息 （ 见表 1） .MHE 患者使用安慰剂前后血清代谢轮廓的分组趋势亦不明显，其模型参数 R2X = 0. 509,表示该模型能解释因变量 50. 9%的变异信息 （ 见表 1） .两个模型的
7、解释能力均欠佳，需要进行有监督的模式识别方法（ OPLS-DA 分析） 进一步分析。OPLS-DA 分析结果： 大黄煎剂组，Q2Y = -0. 097 所对应的模型参数 R2X = 0. 280, R2Y =0. 954 （ 见表 1） ,表明该模型概括了第一主成分（ t 1） 和第二主成分 （ t 2） 两种整体信息的28% ,能解释因变量 95. 4% 的变异信息； 安慰剂组所对应的模型参数 R2X = 0. 397,R2Y = 0. 941,Q2Y = - 0. 605.Q2Y 均为负值，表明两个模型无可预测准确度，模型建立失败，提示 MHE 患者在接受大黄煎剂和安慰剂治疗前后其代谢物谱
8、均无明显差异。4 讨论。MHE 没有明确对应的中医病名，根据其临床表现大致可归于 鼓胀;郁证;症积;不寐;黄疸;等范畴，其病机多为肝气失畅，气滞血瘀； 日久不化，蕴热化火生痰； 毒邪内蕴，腑气不通，蒙蔽脑窍。其中 毒; 痰; 瘀;是导致MHE 发生的关键性病理产物。因此，通过通腑醒神、泄毒降浊化瘀之法，将肠道内 毒; 痰;瘀;之邪排出体外，以达开窍醒神之效。本课题组前期研究表明，大黄煎剂连续灌肠 7 天，可明显改善 MHE 患者神经生理及智力检测结果，疗效较好10 -13.然而大黄煎剂治疗 MHE 的确切作用机制仍尚未被完全阐明，其对 MHE 认知功能的影响是否通过影响患者内源性代谢物而发挥作
9、用？ 因此，本研究采用 GC-TOFMS 和 UPLC-QTOFMS 联合检测的方法来探讨大黄煎剂治疗 MHE 的可能作用机理。本研究结果显示，大黄煎剂对 MHE 患者的血清代谢物谱无明显影响。可能有以下几个原因：1） 大黄煎剂可能是通过影响 MHE 患者体内其他大分子物质而起作用，而 GC-TOFMS 和 UPLC-QT-OFMS 代谢组学检测平台无法检测到这些大分子物质 代谢组学检测技术通常只能检测到分子量（ MW）参考文献。1李瑜元，聂玉强，沙卫红 . 亚临床型肝性脑病的发病率调查J. 中华内科杂志，2000,39（ 9） : 625-627.2曾峥，李瑜元，聂玉强 . 亚临床肝性脑病的流行病学调查J. 中华肝脏病杂志，2003,11（ 11） : 680-682.3姚春，谢武，付蕾 . 解毒化瘀方对轻微型肝性脑病大鼠行为学、学习记忆能力、血浆内毒素、血氨、肝功能及肝脏病理影响随机平行对照研究J. 实用中医内科杂志，2012,26（ 5） : 7-10.