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1、荧光分析法测定维生素 C,维生素 C及维生素C 的测定原理,荧光分析法测定维生素 C实验,荧光分析法测定维生素 C 应用,讲解人：贺政轩,一、维生素 C及维生素的测定原理,1.1维生素C 维生素 C 又名抗坏血酸, 是维持机体正常生理 功能的重要维生素之一,而人体不能自身合成 ，只能 从食物和药物中摄取，因此 ，食品、药物中维生素 C 的分析具有重要意义。,1.2维生素C测定方法 维生素 C 的测定常用的方法有光度法 、 电化学法、滴定法、酶法、色谱法等。 本实验提出了一种新的测定维生素 C 的荧光 分析方法：维生素 C 被 Cu2 +氧化为脱氢 抗坏血酸，再与苯甲酸及十六烷基三甲基溴化铵产生
2、荧光协同增敏作用，通过对体系荧光强度的测定进行维生素 C 的定量分析。,二、荧光分析法测定维生素 C实验,1实验 1. 1 主要仪器与试剂 分子发光仪 :LS - 55 型 酸度计 :pH - 211型 榨汁机 :CW - JE04型 电热恒温水浴锅 :HH. SY11 - N i1型 CuSO4溶液 :2. 0 10- 3 g m/ L 十六烷基三甲基溴化铵 (CTMAB )溶液 :6. 0 10- 4 g /mL 苯甲酸溶液：1. 0 10- 4 g m/ L 维生素 C 标准储备液 :5. 0 10- 4 g /mL, 2 8 （避光保存）； 维生素 C 标准溶液 :1. 0 10- 5
3、 g /mL, 2 8 （避光保存）； NaOH -邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液:pH =6. 0；,1. 2 实验步骤 （1）配置待测样品及空白对照 在 25 mL 比色管中依次加入 0. 6 m L CuSO4 溶液，2. 0 m L十六烷基三甲基溴化铵溶液，2. 0 m L 苯 甲酸溶液 ，一定体积的维生素 C 标准溶液 ，5. 0 mL NaOH -邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液, 用蒸馏水定容，摇匀；以不含维生素 C 溶液为 空白对照。 （2）水浴加热 在 35恒温水浴中加热 30 m in， 将溶液流水 冷却至室温 。 （3）荧光分析 将待测样品放置于样品架上，设定激发波长为 308 nm ，发
4、射波长为 408 nm ，测量荧光强度 F ，以不含维生素 C 的试剂空白为 F0 ，计算 F测 =F - F0 。,2 结果与讨论 2. 1 激发光谱和发射光谱 取 3. 0 mL 维生素 C 标准溶液, 按实验方法进 行操作,分别在 290 330 nm、360 460 nm 内扫描 得到激发光谱和发射光谱如图 1、图 2所示。从图 1、图 2中可看出 ,当激发波长为 308 nm , 发射波长 为 408 nm 时体系的荧光强度最大,试剂空白的荧光 值比较低且稳定, 故本实验选择激发波长为 308 nm ,发射波长为 408 nm 。,1 C u2 + +BA +缓冲溶液 +CTMAB;
5、 2 Cu2 +BA +维生素 C +缓冲溶液 +CTMAB,1 C u2 + +BA +缓冲溶液 +CTMAB; 2 Cu2 +BA +维生素 C +缓冲溶液 +CTMAB,激发光谱,发射光谱,2. 2 试剂加入顺序 按照实验方法操作, 在各试剂加入量相同的情况下, 试验了试剂的不同加入顺序对荧光强度的影 响。试验结果表明, 当所加试剂顺序依次为 CuSO4 溶液、苯甲酸溶液、维生素 C 标准溶液、NaOH -邻 苯二甲酸氢钾缓冲溶液时 ,体系的荧光强度最大，因此选用此加入顺序为最佳试剂加入顺序。,2. 3 缓冲溶液 溶液的pH值对体系荧光强度有较大的影响，试验了不同的pH值对荧光强度的影响
6、。由pH值 荧光强度的曲线可知 , 当 pH 值为 5. 9 6. 2 时 ,荧光强度达到最大值且比较稳定 ,因此确定最佳 pH 值为 6. 0。 缓冲溶液的种类对体系的荧光强度也有一定的影响。试验了以下几种 pH 值为 6. 0 的缓冲溶液 : NaOH - KH 2 PO4 、KH2 PO4 - 硼砂、KH2 PO4 - Na2 H PO4 、NaOH - 邻苯二甲酸氢钾、Na2 H PO4 - 柠檬 酸、NaOH -柠檬酸钠、HA c - NaA c等。试验结果表明 ,当所加的缓冲溶液为NaOH -邻苯二甲酸氢钾时,荧光强度最大且稳定。因此本实验选择NaOH - 邻苯二甲酸氢钾为缓冲溶液
7、 ,其最佳用量为 5. 0 m L。 2. 4 加热温度和加热时间 试验了不同温度对体系荧光强度的影响。结果表明, 当加热温度为 35时，既有利于提高体系反应速度，又不使反应物与产物结构受到破坏。改变 加热时间进行试验, 结果发现，在 35水浴中加热30 m in，体系荧光强度达到最大值且相对稳定。,2. 5 硫酸铜和苯甲酸的用量 其它条件不变，试验了硫酸铜和苯甲酸的用量对体系荧光强度的影响。结果表明，当硫酸铜的用量为 0. 6 m L、苯甲酸的用量为 2. 0 mL 时，体系荧光强度最大。 2. 6 表面活性剂 分别试验了十六烷基三甲基溴化铵 (CTMAB)、 十二烷基磺酸钠及 -环糊精对体
8、系荧光强度的影响。结果表明 ,表面活性剂对体系的荧光强度有一定的增敏效果，其中 CTMAB 对体系的增敏效果最 好。进一步试验了 CTMAB 的用量对体系的荧光强度的影响, 当 CTMAB 的用量为 2. 0 m L 时, 体系荧光强度最大。,三、荧光分析法测定维生素 C 应用,样品测定 取一片维生素C药片，研细，混匀，准确称取 0. 152 0 g 溶于二次蒸馏水中 ，转移至 500 mL 容量 瓶中定容，配成水溶液。再准确移取10 m L此溶液，将其稀释成 100 m L的溶液，作为样品稀释液。 对样品稀释液进行测定并做加标回收试验。 同时利用本法对西红柿和果珍进行测定。准确称取一定量的果
9、珍，将其配成100 mL的溶液。将清洗干净的西红柿榨汁，称取一定量的西红柿汁， 将其配成100 m L的溶液。 其它步骤和维生素 C 药片的测定方法 相同。,样品测定结果列于表 3表 3 样品测定结果(n =3)。由表3可知，用荧光分析法测定维生素C药片、西红柿和果珍中维生素C的含量，回收率为96. 7% 100. 5%准确度较高。,表 3 样品测定结果(n =3),荧光分析法测定维生素 C 具有操作简单 ,精密 度高 ,检出限低等优点, 该法可以应用于水果、蔬菜 和药物中维生素 C 的检测, 适于推广。,谢谢观赏！,The end,利用某些物质受光照射时所发生的荧光特性和强度，进行物质的定性分析或定量分析的方法，称为荧光光谱分析。,使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发生的荧光通过发射单色器照射于检测器上，调节发射单色器至各种不同波长处,由检测器测出相应的荧光强度，然后以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。荧光发射光谱反映物质下能级的信息。让不同波长的激发光激发荧光物质使之发生荧光，而让荧光以固定的发射波长照射到检测器上，然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，所绘制的图即为荧光激发光谱，又称激发光谱。,1.2荧光光谱分析法,