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1、HPV16 E6和 Nanog基因shRNA对宫颈癌SiHa细胞影响的医学研究第一章 前言宫颈癌是危害妇女健康的主要疾病之一，2012 年，全球宫颈癌新发病例527,624 例，引起 265,653 例死亡，其中我国分别占 12%和 11%1。与大多数肿瘤一样，宫颈癌的主要治疗方法是手术和放疗。尽管宫颈癌治疗的临床手术技巧不断完善，医疗设备、药物不断改进，手术、放疗和化疗得到综合应用，但是宫颈癌的治疗效果和预后依然不理想，宫颈癌有很高的转移和复发的风险2, 3，因此，近些年来，研究学者不断深入对宫颈癌的研究，希望能找到更好的治疗方法。肿瘤的基因治疗作为未来一种新的治疗方法受到了越来越多研究学者
2、的重视。1.1 宫颈癌与 HPV 感染在所有恶性肿瘤中，宫颈癌是唯一有明确致病因素的癌症4, 5，研究发现，超过 99.7%的宫颈癌患者的癌变组织中均可以检测到 HPV 病毒 DNA 分子6。根据 HPV 的致癌潜能，HPV 病毒被分为高低两种型别，高危型别主要有 HPV-16，-18，-31，-33，-35，-39，-45，-51，-52，-56，-58，-59，-68，-73，-82，与癌变相关，低危型别主要有 HPV-6，-11，导致良性病变如生殖器疣，轻度鳞状上皮增生7, 8。其中，以 HPV16 型致癌性最强，最容易导致患者发生持续性感染，进而发展成为浸润性宫颈癌9, 10。HPV
3、DNA 与宿主基因组的整合是宫颈上皮细胞发生恶性转化主要机制，病毒 DNA 分子整合入宿主细胞的基因组后会导致HPV 的主要致癌基因 E6、E7 的蛋白大量表达，E6 蛋白结合并降解抑癌蛋白 p53，另一方面可以抑制 p53 蛋白进入细胞核调控相关基因的表达，E7 蛋白结合并降解抑癌蛋白 pRb，使这些抑癌蛋白丧失抑癌功能，致使细胞过度增殖、细胞生长失控，导致细胞的恶性转变，并逐步发展为侵袭性宫颈癌11。.1.2 宫颈癌与 Nanog 基因新近发展起来的肿瘤干细胞理论认为，肿瘤的发生是由肿瘤细胞中一小部分特殊细胞群所导致，这部分细胞具有干细胞特性，能自我更新和分化出异质性细胞。Nanog 基因
4、作为干细胞标志物在肿瘤细胞中的表达同样为这种假说提供了依据，而且有学者认为 Nanog 有可能作为肿瘤诊断的一个敏感性、特异性标志物和治疗靶点。Nanog 基因是 2003 年 5 月发现的一个新的干细胞关键转录因子基因，主要起维持胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES 细胞）亚全能性的作用，与 ES 细胞增殖和分化关系密切12, 13。近些年来的研究发现，Nanog 基因作为肿瘤干细胞分子标志物，在多种癌变组织中过表达，例如肺癌14、乳腺癌15、前列腺癌16、肝癌17、卵巢癌18, 19、结肠癌20和宫颈癌21。Nanog 基因在肿瘤细胞中的异常表达与癌症患者预后密切相关2
5、0, 22-25。研究表明，Nanog 基因可以通过 STAT3/Snail 信号途径来调控肿瘤细胞间质转化（Epithelial MesenchymalTransition，EMT）的改变及转移和侵袭能力26-28，还可以通过调节细胞周期蛋白 Cyclin D1 表达来调控细胞的增殖和凋亡29。Feng Ye 等人的研究发现，Nanog在不同病变程度的宫颈组织中表达量明显不同，随病变程度的加深，表达量逐渐升高，表达差异有明显的统计学意义30。沉默 Nanog 基因在宫颈癌细胞系 Hela细胞中的表达，可以减缓细胞的生长，减弱细胞的转移和侵袭能力，增强其对药物的敏感性25。综上所述，我们推测肿
6、瘤干细胞标记物 Nanog 基因在宫颈癌细胞中的表达，可能与宫颈癌细胞增殖，转移和复发相关，影响宫颈癌患者的治疗效果和预后，可能成为治疗宫颈癌的一个新的基因靶点和分子诊断的一个新的标志物。.第二章 HPV16 E6 和 Nanog shRNA 真核表达载体构建及鉴定2.1 实验材料2.1.1.细胞和载体人宫颈癌 SiHa 细胞株 北京北纳生物研究院载体：pSilencer2.1-U6 美国 Invitrogen 公司菌株：大肠杆菌 DH5α 大连 Takara 公司2.1.2 主要的实验试剂及工具酶DMEM 高糖培养基 美国 Gibco 公司Opti-MEM 无血清培养基 美国 G
7、ibco 公司澳洲胎牛血清 美国 Gibco 公司磷酸盐缓冲液 PBS 美国 Gibco 公司0.25%胰蛋白酶 美国 Gibco 公司T4 DNA 连接酶 大连 Takara 公司胶回收试剂盒 大连 Takara 公司质粒小提试剂盒 大连 Takara 公司.2.2 实验方法2.2.1 shRNA 的设计与合成通过 NCBI 从 Genebank 中选取人 HPV16 E6 和 Nanog 基因的 cDNA 序列，利用 Invitrogen 公司提供的网上 siRNA 在线设计软件进行设计，根据软件给出的结果和 siRNA 的设计原则33，并查阅文献资料，分别针对这两个基因，从中各选取三条已
8、被证实有效的 siRNA 靶序列，同时设计一条阴性对照，七条序列分别进行 BLAST 分析，结果与人类其它基因编码序列无同源性。以设定的 siRNA靶序列为正义链，其反向互补的序列为反义链，将正义链和反义链加到以TTCAAGAGA 为茎环的两端，在正义链的 5，加上限制性内切酶 BamHI 粘端，反义链的 5，端加上 HandIII 粘端，3，端酶切位点之前加入启动子终止信号TTTTTT ，将得到设计的 shRNA 分别命名为 shRNA-E6-1 、 shRNA-E6-2 、shRNA-E6-3、shRNA-Nanog-1、shRNA-Nanog-2、shRNA-Nanog-3、shRNA-
9、Control（见表2-1）。将上述设计的HPV16 E6 的shRNA序列shRNA-E6-1、shRNA-E6-2、shRNA-E6-3 ， Nanog 的 shRNA 序列 shRNA-Nanog-1 、 shRNA-Nanog-2 、shRNA-Nanog-3 及阴性对照 shRNA 序列 shRNA-Control 交由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。.第三章 HPV16 E6、Nanog shRNA 表达对 SiHa 细胞生物学特性的影响.203.1 实验材料.203.2 实验方法.223.3 实验结果.263.4 讨论 .333.5 小结 .373.5 小结本研究利用 RNAi
10、 技术，在基因转录水平上干扰 HPV16 E6 mRNA 的表达，不仅使宫颈癌细胞 SiHa 细胞中 E6 mRNA 表达下调，还可以下调 Nanog 基因mRNA 和蛋白表达，间接说明 HPV16 E6 的表达可以诱导 Nanog 基因的表达。沉默HPV16 E6和Nanog基因在SiHa细胞中的表达，可以在一定程度上减缓SiHa细胞的生长速度，促进细胞的凋亡，减弱细胞的迁移能力。HPV16 E6 和 Nanog基因两者之间可能存在协同作用。.总结本研究采用 RNAi 技术，以人 HPV16 E6 和 Nanog 基因为作用靶点，成功构建了 HPV16 E6 和 Nanog 基因的 shRN
11、A 真核表达质粒，并成功转染宫颈癌 SiHa细胞。RT-PCR 和 Western Blot 结果显示 HPV16 E6 和 Nanog 基因的 shRNA 能有效沉默 E6 和 Nanog 基因在 SiHa 细胞中的表达，HPV16 E6 基因表达下调可以诱导Nanog基因的表达减少，HPV16 E6和Nanog基因的表达减少可以诱导STAT3、Cyclin D1 蛋白表达减少。通过 CCK-8 检测转染后细胞的增殖情况，结果表明 HPV16 E6 和 Nanog 两种基因 shRNA 可明显抑制 SiHa 细胞的增殖，共转染比单独转染对 SiHa 细胞的增殖速度抑制效果更强；Transwe
12、ll 实验结果显示，HPV E6 和 Nanog 基因的沉默表达，可明显减弱 SiHa 细胞的迁移能力，共转染组细胞较单独转染细胞迁移能力更弱；细胞凋亡分析发现，HPV16 E6 和 Nanog 基因的沉默表达使 SiHa 细胞的凋亡明显增多，与单独转染组细胞相比，共转染组凋亡细胞明显增加；细胞周期分析发现，HPV16 E6 和 Nanog 基因的沉默表达使 SiHa 细胞处于中 G0/G1 期细胞比例增多，处于 S 期细胞比例明显减少，表明 HPV E6 和 Nanog 沉默表达使G0/G1 期的细胞不能顺利进入 S 期，延长了细胞的周期，减缓了细胞的增殖速度。综上所述，我们得出结论： HPV16 E6 和 Nanog 基因 shRNA 可明显抑制宫颈癌 SiHa 细胞中 HPV16 E6 和 Nanog 表达。HPV16 E6 和 Nanog 表达下调，导致 SiHa 细胞的增殖速度减慢，凋亡增多，迁移能力减弱。同时沉默 HPV16 E6和 Nanog 基因在 SiHa 中的表达较单独沉默任何一个基因时，对 SiHa 细胞的影响更加明显。.参考文献（略）