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1、辛伐他汀调控内源性干细胞进行退变椎间盘的内源性修复和重建 中国组织工程研究 第21卷 第5期 20170218出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research February 18, 2017 Vol.21, No.5 www. CRTER.org 辛伐他汀调控内源性干细胞进行退变椎间盘的内源性修复和重建 黄泽楠，冯新民，王静成，陈 涛，毕松超，张 亮(扬州大学医学院，扬州大学临床医学院，江苏省扬州市 225001) 综述 引用本文：黄泽楠，冯新民，王静成，陈涛，毕松超，张亮. 辛伐他汀调控内源性干细胞进行退变椎间盘的内源性修复和重建J.中国
2、 组织工程研究，2017，21(5):809-814. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.05.025 ORCID: 0000-0002-9746-1828(黄泽楠) 文章快速阅读： 文题释义： 低氧诱导因子：是一类介导细胞内低氧反应的关键性转录调控因子，目前哺乳动物体内有3种(HIF-1，HIF-2，HIF-3)，常氧时表达很低，低氧时能迅速转移质细胞核，使缺氧诱导基因转录增强，表达产物增多。 髓核：是乳白色半透明胶状体，富于弹性，为椎间盘结构的一部分，位于两软骨板与纤维环之间。由纵横交错的纤维网状结构即软骨细胞和蛋白多糖黏液样基质构成的弹性胶冻物质。 摘
3、要 背景：研究显示，他汀类药物能够促进椎间盘细胞骨形态发生蛋白2、聚集蛋白聚糖及型胶原等细胞外基质mRNA达，同时也能使已去分化的髓核细胞表型发生逆转，从而能减缓椎间盘退变过程。 目的：综述近年来国内外研究辛伐他汀诱导干细胞生物学活性及动员内源性干细胞修复退变椎间盘的研究进展。 方法：由第一作者检索至2016年1月为止PubMed及CNKI中国期刊全文数据库，以“椎间盘退变治疗，内源性干细胞和退变的椎间盘，辛伐他汀和干细胞”等为检索词，共检索102篇相关文献，排除重复研究，共48篇文献符合纳入标准。 结果与结论：综合大量国内外科研人员对椎间盘退变治疗的研究，发现辛伐他汀可以促进低氧诱导因子1的
4、表达，同时低氧诱导因子1又可以调控退变的椎间盘组织中的髓核间充质干细胞的生物学行为。因此，辛伐他汀能够通过此途径来进行退变椎间盘的内源性修复和重建。 关键词： 干细胞；分化；椎间盘退变；低氧诱导因子1；辛伐他汀；髓核间充质干细胞；国家自然科学基金 主题词： 缺氧诱导因子1；间质干细胞；椎间盘；组织工程 基金资助： 国家自然科学基金(青年基金项目，81401830)；中国博士后科学基金资助(2015M571714)；江苏省自然科学基金(青年基金项目，BK 20140496) Simvastatin regulates endogenous stem cells to reconstruct th
5、e degenerative intervertebral disc Huang Ze-nan, Feng Xin-min, Wang Jing-cheng, Chen Tao, Bi Song-chao, Zhang Liang (Clinical Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China) Abstract BACKGROUND: Statins can promote the mRNA expression of bone morphogenetic protein 2
6、, aggrecan and type II collagen in intervertebral disc cells, and they also can reverse the phenotype of dedifferentiated nucleus pulposus cells to slow disc degeneration process. OBJECTIVE: To review the research progress of simvastatin modulating the biological characteristics and mobilizing endog
7、enous stem cells for the repair of intervertebral disc degeneration. METHODS: The first author retrieved the PubMed and CNKI databases for relevant articles published before January 2016 using the key words of “disc degeneration factor, Simvastatin AND stem cells, endogenous stem cells AND disc dege
8、neration” in English and Chinese, respectively. Initially, 102 relevant articles were retrieved, but only 48 articles were included in result analysis following elimination of duplicate studies. ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 黄泽楠，男，1991年生，江苏省泰兴市人，硕士研究生，主要从事脊柱外科方面的研究。 通讯作者：张亮，副主任医师，讲师，扬州大学
9、临床医学院，江苏省扬州市 225001 中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2017)05-00809-06 稿件接受： 2016-12-18 Huang Ze-nan, Studying for masters degree, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China Corresponding author: Zhang Liang, Associate chief physician, Lecturer, Medical College
10、 of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China 809 黄泽楠，等. 辛伐他汀调控内源性干细胞进行退变椎间盘的内源性修复和重建 www.CRTER.org RESULTS AND CONCLUSION: By summarizing a large number of studies on the treatment of intervertebral disc degeneration worldwide, we found that simvastatin may modulate the biologic
11、al characteristics and function of nucleus pulposus mesenchymal stem cells via promoting the expression of hypoxia-inducible factor 1 for the endogenous stem cell-based therapy of intervertebral disc degeneration. Subject headings: Hypoxia-Inducible Factor 1; Mesenchymal Stem Cells; Intervertebral D
12、isk; Tissue Engineering Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81401830; the China Postdoctoral Science Foundation, No. 2015M571714; the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK 20140496 Cite this article: Huang ZN, Feng XM, Wang JC, Chen T, Bi SC, Zhang L. Simv
13、astatin regulates endogenous stem cells to reconstruct the degenerative intervertebral disc. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(5):809-814. 0 引言 Introduction 椎间盘是相对封闭无血管的组织，由内层的髓核组织、外层纤维环以及软骨终板3部分构成。髓核细胞、纤维细胞和软骨细胞是构成椎间盘的主要细胞。这些细胞包埋在由蛋白多糖和胶原蛋白构成的基质中，由于蛋白多糖携带大量的具有高亲水能力的负离子，因此，椎间盘具有水合作用；而胶原蛋白，能够对
14、抗机械压力，从而能够维持椎间盘功能。椎间盘的营养供应主要有终板途径和纤维环途径。然而，软骨终板在机体老化过程中会逐渐钙化，这使得氧气等营养物质的供应和代谢废物的排泄受阻。结果使得椎间盘微环境遭到破坏，随后加上炎症因子的刺激 ，最终引起椎间盘细胞的细胞数量及其细胞外基质的减少，纤维环结构改变，从而产生一系列椎间盘退变性疾病。 椎间盘退变性疾病是指由椎间盘退变引起的以颈肩腰腿痛为主要表现的症候群，包括临床上常见的颈椎病、腰椎间盘突出症和椎间盘源性腰痛。调查显示椎间盘退变性疾病是25-55岁产生后背痛最主要的原因之一，由于这类患者丧失劳动力，所以造成极大的社会和经济负担。在临床上，虽然手术治疗能够部
15、分缓解患者的症状，但只能处理责任节段的椎间盘，对于椎间盘退变本身并未起到治疗作用。远期效果当然就不甚理想。既往认为椎间盘细胞处于是一种低氧、高渗和高压的微环境中，外周的纤维环具有较低的再生能力而中央的髓核组织基本不具有修复能力，因此认为椎间盘并未有干细胞的存在。但随着组织生物学技术的出现和发展，治疗椎间盘退变已步入再生修复和功能重建阶段。2007年，Risbud等1 首次通过分离和培养人退变的椎间盘组织发现在退变的椎间盘中存在一类细胞能够表达前提细胞表面抗原分子如CD105+ ，CD166+ ，CD63+ ，CD90+ ，CD73+ 等，这类细胞具有成脂，成软骨及成骨的能力，这表明此类细胞为前
16、体细胞。Blanco等2 进行类似的研究，发现这类细胞能够贴壁生长，可完成三系诱导分化，符合国际细胞治疗学会有关间充质干细胞的界定标准，且能特征性表达一系列间充质干细胞表面蛋白分子，所以将其命名为髓核间充质干细胞。 近年来，随着组织工程学及干细胞生物学研究的不断深入，通过运用内源性干细胞在体内的迁移和运动机制来诱导自身干细胞激活从而进行内源性修复和重建 810 退变的椎间盘，具有广阔的研究前景和临床应用空间。同时研究发现，辛伐他汀在调节干细胞定向分化的过程中扮演了重要的角色。故文章就辛伐他汀通过诱导低氧诱导因子的表达来调节髓核间充质干细胞的生物学行为最终能够修复和重建退变的椎间盘做一综述。 1
17、 资料和方法 Data and methods 1.1 资料来源 第一作者检索PubMed和CNKI数据库2000年1月至2016年1月相关文献，英文关键词为“Simvastatin，Nucleus Pulposus Stem Cells，HIF-1，Intervertebral Disc Degeneration”；中文关键词为“椎间盘退变治疗，内源性干细胞和退变的椎间盘，辛伐他汀和干细胞”。 1.2 检索方法 纳入标准：有关辛伐他丁调节干细胞生物活性从而修复和重建退变的椎间盘的文章；具有原创性，论点论据可靠的文章；对于同一领域的文献选择近期发表或者权威杂志的文献。排除标准：较陈旧性观点以及
18、一些重复性研究。质量评估：计算机初检得到102篇英文文章，阅读标题和摘要进行初筛，排除研究目的与本文无关及内容重复的文献，最后保留其中48篇归纳总结。 2 结果 Results 2.1 干细胞治疗椎间盘退变性疾病的研究现状及困难 2.1.1 干细胞治疗椎间盘退变性疾病的研究现状 目前，干细胞移植治疗研究主要包括自体或异体椎间盘细胞移植，其中研究最热的是骨髓间充质干细胞的移植。自 Risbud 等3 首次证实骨髓间质干细胞在低氧和转化生长因子1条件下可向类髓核细胞分化后，不同动物和人多种组织来源(如骨髓，脂肪，脐带，滑膜和肌组织等)的成体干细胞及多能干细胞在体外均可向类髓核细胞分化 4-7 ，这
19、为利用干细胞治疗椎间盘退变性疾病提供了 理论可能。Sakai等8 制作兔退变椎间盘模型，首次成功移植骨髓间充质干细胞并进行连续48周的骨髓间充质干细胞记数，采用免疫组织化学法测定分化的骨髓间充质干细胞数量，RC-PCR半定量测定椎间盘蛋白聚糖含量，结果发现移植的骨髓间充质干细胞能够持续存活且不断地增殖，并能分化且表现出髓核细胞的特征，另外还可以促进髓核细胞外基质表达。他们进一步研究通过 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org 黄泽楠，等. 辛伐他汀调控内源性干细胞进行退变椎间盘的内源性修复和重建 www.CRTER.org LacZ基因标记自
20、体间充质干细胞，采用Atelcollagen支架包埋骨髓间充质干细胞，并将支架植入兔的椎间盘退变模型，并与正常组及退变模型假手术组进行对照，从免疫组织化学，组织学，影像学包括X射线、MRI等及基质相关基因的表达等方面进行观测，结果发现在椎间盘修复方面的效果，移植骨髓间充质干细胞组要优于假手术组，这表明自体干细胞移植治疗椎间盘退变是具有广阔的前景9 。这些体内外实验研究均已取得令人振奋的结果，证实干细胞移植治疗有效，而其中间充质干细胞具有获取容易，又具有向髓核细胞分化和传代繁殖能力，以及比较低的免疫免疫原性等特点。 为了让移植的干细胞能够更好存活并发挥功能，细胞支架三维培养及细胞因子逐渐被应用。
21、Yang 等 10 将 负载有骨髓间充质干细胞及转化生长因子1的支架植入兔退变椎间盘内，并与退变组及只移植转化生长因子1组进行对照，从免疫组织化学，组织学，影像学包括X射线、MRI等及基质相关基因的表达等方面进行观测，结果发现负载骨髓间充质干细胞及转化生长因子1支架组与退变组及单纯移植转化生长因子1组相比，髓核细胞凋亡被抑制，椎间盘高度丢失减慢。 2.1.2 干细胞治疗椎间盘退变性疾病的困难 当然，在尝试使用干细胞治疗椎间盘退变性疾病的同时，也发现了相关问题。Vadala将兔骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增，3周后按1105 将骨髓间充质干细胞注射入退变椎间盘，并与未移植组进行对比，3，9周后
22、通过MRI并未发现退变椎间盘修复表现，反而在注射节段椎间盘前外侧发现大量骨赘形成，周围包绕含标记干细胞的软骨，提示移植的间充质干细胞可能从纤维环渗漏并造成令人意想不到的麻烦11 。同时对于移植后间充质干细胞的状态进行进一步研究，发现大部分间充质干细胞滞留在移植区域，仅有少部分发生迁移，而且耗时很长，很难达到有效修复椎间盘退变的目的 12 。另外，由于干细胞移 植都必须经过实验室干细胞分离、培养、定向诱导分化甚至基因操作，存在来自干细胞的内源性的和操作过程中外源性的生物危害风险。同时自体和同种一体干细胞移植治疗均已有致瘤的报道 13-14 。由此可见，外源性干细胞移植治疗椎间盘退变性疾病仍存在一
23、定的问题。 2.2 椎间盘内源性干细胞的相关性研究 2.2.1 髓核间充质干细胞 随着对干细胞了解的不断深入，逐渐理解内源性干细胞在体内的迁移和运动的机制，利用此机制来诱导自身干细胞激活从而能够内源性修复和重建退变的椎间盘，这有望解决如体外干细胞在移植区域停滞等困难，具有广阔的研究前景和临床应用空间 15 。2010年Blanco等用型胶原酶消化了人的退变 椎间盘髓核组织，首次从中分离和培养出间质干细胞，并与骨髓间充质干细胞对比，发现该细胞在形态学和免疫组织化学等方面与骨髓间充质干细胞相类似，但是新 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 培养出的间
24、充质干细胞虽然也具有成软骨及成骨能力，却没有成脂能力，同时发现此类细胞符合国际细胞治疗学会有关多能间质干细胞的界定标准 2，16-17 。Li等 18 从SD 大鼠腹股沟脂肪与椎间盘中分别分离出脂肪间充质干细胞和髓核间充质干细胞，并分别臵于体积分数20%氧气和体积分数2%的氧气环境中培养增殖14 d，结果发现在模拟椎间盘内低氧环境下，髓核间质干细胞较脂肪间充质干细胞表现出更好的活力、增殖能力及向髓核细胞分化的能力。Tao等19 将髓核细胞和髓核间充质干细胞在模拟椎间盘内高渗透压的微环境中进行体外共培养，发现椎间盘内的高渗透压环境对于髓核细胞增殖及细胞外基质合成具有轻度抑制作用，但是髓核间质干细胞能够可以较好地耐受高渗透压，同时髓核细胞/髓核间质干细胞共培养可促进细胞增殖及细胞外基质合成。以上结果显示能够把退变椎间盘髓核组织中的内源性干细胞-髓核间充质干细胞作为新的种子细胞来修复和重建退变的椎间盘。 2.2.2 低氧微环境对干细胞的影响 目前研究的热点是如何使得间质干细胞更好的向目标细胞分化。干细胞具有自我分化和更新的能力，因此其所处得微环境也相当重要。现研究发现干细胞存在于低氧微环境内 20-21 ， 推测低氧可能有助于维持干细胞/前体细胞的未分化表型。椎间盘内的细胞尤其是髓核细胞长期处于细胞外基质如蛋白聚糖及胶原等的包围中，所以处于一种极端的低氧甚至无氧环境中