《基因工程常用技术9.18.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程常用技术9.18.ppt（121页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、第三章 基因工程常用技术,一、质粒DNA的提取 二、核酸凝胶电泳技术 三、核酸分子杂交技术 四、聚合酶链反应(PCR)技术 五、DNA序列分析技术,质粒DNA的提取是基因工程操作中最基本的技术，最常用的是碱裂解法。,一、质粒DNA的提取,在强碱性溶液中，DNA双链的氢键断裂变性；当溶液恢复中性时，DNA双链复性。,（一）碱裂解法提取质粒DNA,1、原理,4,在变性后双链不分离、复性快。,共价闭合环状的质粒DNA：,5,线性染色体DNA：,2、碱裂解法质粒DNA提取的步骤,1）溶菌,7,葡萄糖：,增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力的作用而降解（震荡）。,EDTA：,Mg2+、Ca2+螯
2、合剂，抑制DNase活性，防止DNA被降解。,8,溶菌酶：,为糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分-肽聚糖中的-1,4糖苷键，具有溶菌作用 。,2）变性,10,NaOH：,是强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。,是离子型表面活性剂，溶解细胞膜和细胞内蛋白，并结合成“蛋白质-SDS”复合物，使蛋白质（包括DNase）变性沉淀。,SDS：,11,3）中和,12,KAc：,用冰HAc把KAc溶液的pH调到4.8，以中和NaOH变性液，使DNA复性。,高浓度KAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA、蛋白质-SDS复合物沉淀。,冰HAc ：,13,上清液中含有质粒DNA。,4）离心
3、去除沉淀,5）纯化DNA,酚-氯仿-异戊醇（25: 24: 1）抽提或柱层析。,15,酚：,比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚。,蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。,防止抽提时振荡起泡。,氯仿：,异戊醇：,16,2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。,6）沉淀DNA,DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。,17,70%乙醇洗涤DNA，干燥。,7）洗涤,8）贮存 用含RNaseA(20g/ml)的TE溶解DNA，贮存于-20。,18,TE：,由Tris-HCl缓冲液和EDTA配制。,EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。,Tris
4、-HCl不含金属离子（不同于磷酸或硼酸缓冲液），利于后续操作。,RNaseA：,降解残留的RNA。,许多公司研制出商品化质粒提取试剂盒，原理大多依照碱裂解法，但在纯化步骤上采用柱层析。,20,3、影响质粒DNA产量的因素,质粒的产量受提取过程中各因素的影响，但最重要的是菌株的遗传背景和质粒自身的拷贝数。,一般使用endA基因突变的E.coli菌株，如DH5、JM109等。,1）受体菌株,endA基因编码核酸内切酶I，在Mg2+存在下，可将双链DNA消化为7bp的寡核苷酸片断。,22,常用质粒的理论产量,质粒 分子大小 拷贝数 质粒产量 （kb） （g/ml）,（二）DNA的定量和纯度测定,1、
5、紫外光谱法,原理：基于DNA在260nm波长处有特异的紫外吸收峰（蛋白质在280nm处有吸收峰），用微量比色杯在紫外分光光度计直接测定。,在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml。,26,纯DNA样品：OD260/OD280 =1.8 OD260/OD230 2.0,OD260/OD230 2.0：有残存的盐和小分子杂质， 如核苷酸、氨基酸、酚等。,OD260/OD280 1.6：有蛋白质污染；,OD260/OD280 1.9：有RNA污染；,27,原理：利用溴化乙锭(EB)能插入DNA分子中，在紫外光照射下能发红色荧光，将其荧光强度与已知浓度的DNA(如D
6、NA marker)电泳条带对比，可估算出DNA含量。,2、琼脂糖凝胶电泳估计,（三）DNA分子量的估计,通过琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA marker对比得知。,二、核酸凝胶电泳技术,（一）电泳的基本原理,生物大分子在一定pH条件下，通常带电荷，将其置于电场中，会以一定的速度向与其电荷性质相反的电极迁移，迁移速度称电泳速率。,30,摩擦系数与分子的大小、构型及介质的粘度有关。,电泳速率与电场强度、分子所带的净电荷数成正比，与分子与介质的摩擦系数成反比。,在生理条件下，DNA分子糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态，故DNA实际上呈多聚阴离子状态，在电场中向 方向迁移。,糖-磷酸骨架在
7、结构上重复，故等量的双链DNA几乎带等量的净电荷。,正极,32,如电场强度一定、电泳介质相同，电泳速率就取决于核酸分子的大小和构型。,构型相似的分子：分子量越大、迁移越慢。,分子量相同的分子(如质粒)： cccDNA迁移最快、L-DNA次之、ocDNA最慢。,33,固体支持介质：,琼脂糖(agarose) 聚丙烯酰胺(polyarylamide),固体支持介质可形成复杂的网孔结构，DNA穿过这些网孔才能到达正极。,分子量小、结构致密的DNA分子更易穿过网孔，泳动速度也越快。,（二）琼脂糖凝胶电泳,是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。,琼脂糖：,37,琼脂糖凝胶：,琼脂糖在电泳液
8、中加热到沸点后溶解，冷却后凝固成均匀的胶体“胨”，成为很好的电泳介质。,38,琼脂糖浓度(%) 分离DNA的范围(kb),0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3,琼脂糖浓度的高低决定凝胶孔隙的大小，浓度越高、孔隙越小、分辨率越高。,（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺：,由丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺聚合而成。,40,在过硫酸铵和TEMED存在时，丙烯酰胺单体形成长链，由N,N-甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由基团反应而发生交联，形成聚丙烯酰胺。,为中枢神经毒物，尽量避免接触和吸入!,
9、过硫酸铵：,催化过硫酸铵产生自由基，加速聚合。,丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺：,碱性条件下产生自由基。,TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二铵)：,42,聚丙烯酰胺浓度(%) 分离DNA的范围(bp),3.5 1000-2000 5.0 85-500 8.0 60-400 12.0 40-200 15.0 25-150 20.0 6-100,聚丙烯酰胺浓度的高低决定凝胶孔隙的大小，浓度越高、孔隙越小、分辨率越高。,43,0.3-2%琼脂糖凝胶电泳分辨率：60,000-100bp；,3.5-20%聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率：2,000-6bp。,44,（四）电泳缓冲液,Tris-乙酸（TAE
10、） Tris-硼酸（TBE） Tris-磷酸（TPE）,TAE价格便宜，但缓冲容量低； TBE与TPE缓冲容量高，分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，易使DNA沉淀。,45,EDTA可螯合二价阳离子，抑制DNase活性，防止DNA被降解。,临用时用水稀至0.5TBE（20倍稀释）,10TBE缓冲液的配制： Tris碱 108g 硼酸Boric acid 55g EDTA 9.3g 加H2O至 1L（调PH为8.0-8.2）,46,（五）核酸电泳的指示剂与染色剂,1、指示剂：,常用溴酚兰，在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，迁移率分别与1kb
11、、0.6kb、0.2kb和0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。,47,使样品呈色，便于加样操作；,指示剂与蔗糖、甘油组成加样缓冲液。,增加样品比重，确保DNA均匀沉入加样孔；,在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测DNA电泳的速度和位置。,48,49,2、染色剂：,核酸电泳后，需经染色才能显出带型。,溴化乙锭染色法 银染色法,50,溴化乙锭(ethidium bromide, EB)能插入到DNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出红色荧光。,1）溴化乙锭染色法：,51,可将EB直接加到凝胶介质中（终浓度0.5g/ml）；也可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10-
12、15min。,EB与DNA分子结合，而不与凝胶结合，DNA分子吸收EB并发出荧光。,52,琼脂糖凝胶EB染色后，在紫外光下观察，可检测出50ng的DNA。,在适当染色条件下，荧光强度与DNA片段的数量成正比。,53,2、银染色法：,Ag+可与核酸形成稳定的复合物，用还原剂(如甲醛)使Ag+还原成银颗粒，可将电泳条带染成黑褐色，用于聚丙烯酰胺凝胶染色。,优点：灵敏度比EB高200倍。,缺点：银染色后，DNA不宜回收。,聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染结果,银染10min,银染15min,三、核酸分子杂交技术,1968年，华盛顿卡内基学院的Roy Britten及其同事发明。,依据：碱基互补、变性和复性,
13、随温度逐渐降低，变性的两条单链重新 形成互补双链。,在高温下，核酸双链解为两条单链；,利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针(probe)，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补同源核酸序列的存在。,（一）核酸探针,指一段带有检测标记、与目的DNA片段特异互补、已知序列的核酸片段。,探针长度一般以50-300bp为宜。,核酸探针的种类：,放射性探针 非放射性探针,寡核苷酸探针(oligonucleotide probe),根据生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针；,简并探针的设计依据：,参考生物体EST(expressed sequence
14、tag)数据库，进行倾向性简并序列设计。,EST：对一个随机选择的cDNA克隆，进行5端和3端单一次测序，获得的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，平均长度360120 bp。,寡核酸探针的优点：,序列短，杂交速度快、特异性强；,可在短时间内大量制备；,可在合成中进行标记；,可合成单链探针，避免双链探针在杂交中自我复性，提高杂交效率；,可检测靶序列内1个碱基的变化。,寡核苷酸探针的设计原则：,长度18-50bp；,G+C含量40-60%；,避免同一碱基连续出现（不能多于4个） ；,与非靶序列70%以上同源性、或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。,64,1、标记物的种类：,前者更敏感
15、，但后者保存时间较长，无同位素污染。,非放射性：生物素、地高辛、荧光素等。,放射性：32P、35S、125I等；,（二）核酸探针的标记,缺刻平移法 随机引物延伸法 反转录标记法 末端标记法,2、探针标记方法：,1）放射性同位素标记：,1）Klenow酶介导的3末端标记法：,末端标记法,67,2）TdT介导的3末端标记法：,3）T4-PNP介导的5末端标记法：,69,2）非放射性同位素标记：,酶促反应标记法 化学修饰标记法,将标记物预先标记在核苷酸分子上，再利用酶促反应，将标记的核苷酸掺入探针中。,酶促反应标记法,1）标记物-dUTP的生成； （如Bio-11-dUTP、Dig-11-dUTP）
16、,71,Bio-11-dUTP：,生物素(Biotin),Biotin与dUTP之间连接臂的碳链长度。,11：,Bio：,广泛存在于各种组织中，若样品本身含内源性生物素，会对结果产生干扰。,72,Dig-11-dUTP：,地高辛(digoxigenin)；,Dig：,洋地黄植物的花和叶是Dig在自然界中的唯一来源，抗Dig抗体不会与其他生物物质结合，可满足特异性标记的需要。,从洋地黄植物中提取的类固醇物质。,地高辛系统标记：,化学修饰标记法,利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生的化学反应，将标记物直接结合到探针分子上。,ABC荧光标记：,ABC：Avidin Biotin Comp
17、lex,ABC显色酶标记：,ABC：Avidin Biotin Complex,（三）核酸分子杂交的分类,待测核酸样本先结合到固相支持物（硝硝酸纤维素膜、尼龙膜等）上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。,待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应。,液相杂交：,固相杂交：,液相核酸分子杂交,固相核酸分子杂交,预杂交：消除膜对探针的非特异性结合，降低杂交背景。,Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 斑点杂交/狭缝杂交 菌落杂交 夹心杂交 原位杂交,常用固相核酸杂交方法,1、Southern印迹杂交,是将DNA分子从电泳凝胶转印到硝酸纤维素膜上，进行核酸杂交的一种实验方法
18、。 1975年，由英国爱丁堡大学的Edwen Southern创建，故称Southern blot。,提取DNA样本限制酶酶切琼脂糖凝胶电泳分离NaOH变性DNA转印至膜上预杂交标记探针与之杂交放射自显影或显色反应检测杂交信号结果分析。,Southern blot的基本过程：,用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。,83,水稻叶绿体DNA分别用Bgl II(A-C)、BamH I(D-F)、EcoR I(G-I)、Hind III(J-L)消化，琼脂糖凝胶电泳分离，然后与32P标记的玉米psbA探针Southern杂交，X光底片中显现阳性条带，表明含玉米psbA基因序列。,2、Norther
19、n印迹杂交,1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素膜上，进行核酸杂交的一种实验方法。 方法与Southern blot类似，故称Northern印迹杂交（ Northern blot）。,提取RNA样本RNA变性琼脂糖凝胶电泳分离转印至膜上预杂交标记探针与之杂交放射自显影或显色反应检测杂交信号结果分析。,Northern blotting的基本过程：,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,87,3、斑点杂交/狭缝杂交 （spot/slot blot hybridization）,基本过程： 将变性的DNA或RNA直接点到膜上，或通过一个长形狭
20、缝转印至膜上膜变性预杂交标记探针与之杂交放射自显影或显色反应检测杂交信号结果分析。,DNA样品,90,简便、快速、灵敏、样本用量少。,特异性不高，有一定比例的假阳性。,优点：,缺点：,需两个靠近且不重叠的探针，一个作固相吸附探针，另一个作标记检测探针。,4、夹心杂交(sanwich hybridization),优点：,样品不需固定，对粗制样品即能做出可靠的检测。,特异性强，只有两个探针都杂交时，才能产生可检测的信号；,93,注意：,为避免产生高本底信号，两探针必须分别克隆入两个非同源载体内，如一个克隆入PUC19，另一克隆入pBR322。,5、菌落杂交(colony hybridizatio
21、n),基本过程： 将菌落从平板转移到硝酸纤维素膜上裂解菌落、释放DNA将DNA烘干固定于膜上标记的探针与之杂交放射自显影检测杂交信号与平板上的菌落对位。,用于从大量菌落中筛选含特异DNA序列的目的重组子。,6、原位杂交(in situ hybridization, ISH),是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术，可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性、定量及定位分析。,97,优点： 不需提取核酸，可完整保持组织或细胞的形态，更准确地反映组织细胞的功能状态。,FISH检测HER-2基因在 乳腺癌组织中的表达,FISH检测慢性粒细胞白血病的 费城染色体(22和
22、9号染色体异位),是利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。,四、聚合酶链反应技术 （polymerase chain reaction, PCR）,1、模板:,（一）PCR反应系统的组成,无论哪种DNA，都要有较高的纯度。,可以是DNA或RNA。,mRNA cDNA PCR，称为RT-PCR。,逆转录,RNA作为模板时，需要：,RT-PCR：Reverse Transcription PCR,2、Taq DNA聚合酶,引物设计的原则：,长度适宜，一般15-30bp；,G+C含量40-60；,4种碱基应随机分布；,内部不
23、应存在互补序列；,两条引物之间不应有多于4个碱基的互补；,3端不应有任何修饰；,5端可修饰，如32P、生物素、荧光素。,上游引物5端： 起始密码子ATG；,注意：,下游引物5端： 终止密码子TAA、TAG或TGA；,上、下游引物5端： 限制酶识别序列及其保护碱基。,104,5 GGAATTCCCTATGACCCAG 3,不同限制酶需保护碱基的数量不同，如： EcoR I 1 Hind III 3 BamH I 2-3 Pst I 4,保护碱基数量不合适，会影响限制酶酶切。,保护碱基,4、dNTPs,终浓度：50mol/L，4种dNTPs浓度应相等。,注意：不稳定，保存时间长会失效.,1）不同的
24、酶需不同Mg2+：,5、Mg2+：,107,EDTA鳌合Mg2+； 选择低浓度TE(10mM Tris, 1mM EDTA)；,如扩增效率不理想，注意调整Mg2+浓度！,2）外界影响：,DNA模板、引物、dNTPs的磷酸基团均可结合Mg2+。,模板DNA 0.1-2 g 引物 各10-100 pmol Taq酶 2.5 U 4种dNTP混合物 各200 mol/L Mg2+ 1.5 mmol/L ddH2O,标准的PCR反应体系：,100 L,1、变性温度：,（二）PCR参数,94-95，一般30-45 sec。,模板DNA完全变性对RCR能否成功至关重要。,可95加热3-5min预变性。,1
25、10,2、退火温度：,退火温度介于55-72之间，一般选择Tm-5；,选择较高的退火温度，可减少引物与模板 非特异性结合，提高PCR的特异性。,111,3、延伸温度：,72，一般40-60sec。,72时，Taq酶处于最高的活力状态，反应速率约35-100nt/s。,延伸时间视扩增片段的长短而定，如扩增1-2kb的PCR产物，延伸1min已足够。,112,4、循环次数,取决于模板浓度，一般选择30次。,分析性PCR一般25-30次，制备性PCR一般30-35次，不超过40次。,循环次数太多会使非特异性产物增加。,113,常采用的PCR条件：,72 保温 10 min,95 预变性 5 min,
26、4 终止 forever,五、DNA序列分析技术,目前用于测序的主要技术：,双脱氧链末端终止法 化学降解法,双脱氧链末端终止法,1977年，英国剑桥大学Frederick Sanger发明。,1）在单链模板、引物、4种dNTPs存在时，Klenow酶能不断地将dNTP加到引物3-OH末端，合成出与单链模板互补的新链。,基本原理：,2）Klenow酶还能以ddNTP作为底物，使之掺入正在延伸的DNA链中，但因ddNTP缺少3-OH，无法和下一个核苷酸之间形成磷酸二酯键，故在ddNTP掺入位置，链延长终止。,脱氧核苷三磷酸（dNTP） 双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）,117,双脱氧末端终止测序法的基本操作：,A,C,G,T,ssDNA,ssDNA,ssDNA,ssDNA,Primer,Primer,Primer,Primer,Klenow,Klenow,Klenow,Klenow,dNTPs,dNTPs,dNTPs,dNTPs,ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP,DNA聚合反应,-32P-dATP,-32P-dATP,-32P-dATP,-32P-dATP,118,OH 3,5 P,3730全自动测序仪,