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1、第七章 酶的别构效应,一、别构酶与代谢调节 二、别构酶的基本概念 三、别构机制的模式 四、引起非双曲线动力学的其他现象,酶的别构效应,本章中将讨论一些不符合米氏方程的酶动力学，即非双曲线动力学。有些影响酶活性的效应剂（包括激活剂和抑制剂）作用于酶活性部位以外的部位，通过酶分子构象的改变来调节酶的活性。这种效应叫做别构效应（allosteric effects），这种效应剂叫做别构效应剂，受别构效应剂影响的酶叫别构酶（allosteric enzyme）。,一、别构酶与代谢调节,生物体内的物质代谢都是在酶的直接作用下进行的，要使物质代谢协调有序地进行，酶活性必须根据情况适时地改变。利用别构效应调
2、节酶活性是各种酶活性调节方式中最迅速的一种，大多数代谢物的反馈抑制就属于别构调节，也有一些代谢物可对代谢途径中的酶起别构激活作用。,1别构抑制作用,反馈抑制可分为五种类型： 线性通路中的反馈抑制 一条途径的最终产物抑制途径中起始酶的活性。,E1,别构抑制作用, 趋同通路中的反馈抑制 为了有效地合成D，要求B和C的浓度大致相等。当C浓度大时，对产生B的途径的最初的酶有激活作用；当B浓度大时，对产生B的途径的最初的酶有抑制作用。,别构抑制作用, 趋散通路中的反馈抑制 EC和ED为两种同工酶，分别受C和D的反馈抑制。当C太多时，不仅抑制从B到C的第一个酶，而且抑制从A到B的第一个反应两种同工酶中的一
3、种，使得B合成的速率下降。B的合成不能完全停止，因为合成D还需要B。当D太多时情况相似。,别构抑制作用, 顺序反馈抑制 一条途径中有多个反馈抑制步骤。, 协调反馈抑制 需要多种代谢物共同作用才能发挥反馈抑制作用。,2别构激活作用,当一种代谢物积累后，激活某些酶，从而加强别的代谢途径。如有氧呼吸旺盛时，ATP大量合成，AMP和ADP减少，由于AMP和ADP是异柠檬酸脱氢酶的激活剂，因此异柠檬酸和柠檬酸浓度增高，柠檬酸能激活乙酰CoA羧化酶和己糖激酶，同时抑制PFK（磷酸果糖激酶）。激活乙酰CoA羧化酶可增强脂肪酸的合成，激活己糖激酶且抑制PFK，可使G-6-P更多地进入磷酸戊糖途径，合成更多的N
4、ADPH，供脂肪酸合成使用。,二、别构酶的基本概念,1一个典型的别构酶天冬氨酸转氨甲酰酶 天冬氨酸转氨甲酰酶（aspartate trans-carbamoylase, ATC）是嘧啶核苷酸生物合成途径的第一个酶（ UTP CTP）。,天冬氨酸转氨甲酰酶,ATC的活性受到CTP的强烈抑制，又受到ATP的高效激活。,天冬氨酸转氨甲酰酶,在对照、加ATP、加CTP三种情况的V对S图中可以看出，对照呈S形曲线而不是双曲线；加ATP减小了反应的表观Km值，使曲线向双曲线靠近；加CTP增大了反应的表观Km值，使曲线的S形更加明显。加ATP和CTP并不影响Vm。,天冬氨酸转氨甲酰酶,ATC的结构与功能,为
5、了解释这种现象，研究者设想在酶分子中有两个分开的部位，一个部位与底物结合并催化反应，另一个部位是ATP或CTP等效应剂的结合位点。利用选择性修饰法修饰后一个部位后，ATC的活性并不丧失，但对CTP抑制的敏感性下降，这种现象称为脱敏作用。选择性修饰实验证实了两个部位的设想。现在我们知道，ATC由12条多肽链组成，2个3亚基，3个2亚基。,ATCase的亚基结合方式,r,r,c,c,ATC 的特点,根据对ATC的研究，得出了5点结论： 酶分子上有两个结合部位，结合底物并催化反应的部位叫活性部位，结合效应剂的部位叫别构部位或调节部位。 这两个部位能同时分别被底物和效应剂占据。 调节部位可与多种效应剂
6、结合，并产生不同的效应。 效应剂的结合影响酶分子的构象，从而影响酶与底物的结合能力和催化能力。 调节部位的效应是构成别构抑制或别构激活的基础，而后两者又是代谢调节的有效方式之一。,2别构酶的协同效应,协同效应（cooperative effects）也是多亚基别构酶的一个特征。能与酶结合的底物、激活剂和抑制剂统称配体，所谓协同效应是指当一个配体与酶结合以后，可以促进或抑制另一个配体与酶结合。,（1）协同效应的分类, 同种效应和异种效应 同种效应（homotropic effects）指的是一分子配体与酶结合后影响另一分子同种配体与酶的结合；异种效应（heterotropic effects）指
7、的是一分子配体与酶结合后影响另一分子异种配体与酶的结合。,协同效应的分类, 正协同和负协同 一分子配体与酶结合后促进另一分子配体与酶结合叫正协同（positive cooperation），抑制另一分子配体与酶结合叫负协同（negative cooperation）。 同种效应一般是正协同；异种效应有正协同，也有负协同。,（2）协同效应的鉴别方法,通过动力学作图，可以鉴别底物之间的正协同、负协同和无协同。,动力学作图法鉴别协同效应,（3）协同指数和协同系数,协同指数（cooperative index，CI）是指酶的底物结合位点被底物饱和90%和饱和10%（即V = 0.9Vm和V = 0.1
8、Vm）时的底物浓度之比，故协同指数又称饱和比值（Ratio saturation，Rs）。,对于一个可结合n个底物分子的酶，其反应式可用下式表示： 按米氏方程的推导过程可得 式中 这里假设n个底物是同时结合上去和同时解离下来的。,协同系数,return,协同系数,当V = 0.9Vm 时，S0.9 = ； 当V = 0.1Vm 时，S0.1 = 。,CI = Rs = =,协同系数 n 的意义,因此，当n1时，CI81，和以前讲过的单底物单产物反应的米氏方程相同，无协同效应。当n 1时，CI 81，为负协同，表示V对S改变的灵敏度减小，且n越小负协同效应越大。n值即为协同系数。,CI = Rs
9、 = =,n 值的理论错误,从理论上推导上式时，n是与酶结合的底物分子数，但实际上测出的n值（测定方法见后）有小于1的情况。上面说的n 1、n1、n 1指的是实际测定值，这是因为推导上式时的前提就不正确，n个底物并不是同时结合上去和同时解离下来的。,别构效应剂对n值的影响,别构激活剂常可减少正协同效应（底物和底物之间的正协同）的n值，使正协同效应减弱，在V对S作图中，可使S形曲线趋向双曲线。相反，别构抑制剂常可增加正协同效应的n值，使正协同效应增强，使S形曲线弯曲更加明显。,（4）半位反应性,兔肌和细菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶由4个同种亚基组成，每个亚基上有1个NAD+结合位点，但实验结果发现该
10、酶往往只能结合2个NAD+分子，这就是半位反应性。半位反应性实际上是一种极端的负协同效应，当第一、二个NAD+与酶结合后，第三个结合位点与NAD+的亲和力已降得很低，实际上已不能与NAD+结合。,（5）协同效应的生理意义,异种协同效应分为别构激活（异种正协同）和别构抑制（异种负协同）效应。它们的意义就是通过效应剂与酶结合来激活或抑制酶的活性，从而调节代谢速率。,异种协同效应的生理意义,协同效应的生理意义,正协同效应提供了一个V对S的敏感区域，即S形曲线中的“陡段”，当细胞内底物浓度处于这个“陡段”时，S的轻微变化可使V发生很大的变化，有稳定S的作用。当细胞内底物浓度处于低S的平缓段时，S的变化
11、不会使V有太大的变化，有稳定V的作用。别构激活剂和别构抑制剂可使“陡段”左移和右移。,底物引起的同种正协同效应,协同效应的生理意义,底物引起的同种负协同效应在更大的S范围里使V稳定，如3-磷酸甘油醛脱氢酶在低NAD+浓度时，能顺利地进行糖酵解，而当其他反应影响使NAD+浓度增加时，即使大幅度地增加NAD+（100倍以内），都可因其半位反应性而不增加酶反应速度。,底物引起的同种负协同效应,3别构酶的其他动力学术语, S 0. 5 前面式中的KS= Sn时， 。由 于别构酶不符合米氏动力学，我们将 时的底物浓度称为表观 Km 或 S 0. 5 。,前面的式,别构酶的其他动力学术语, K型效应剂和V
12、型效应剂 在别构效应剂中，只影响表观Km（或者说S 0. 5）的效应剂称为K型效应剂，它们与竞争性抑制剂的效应相似；竞争性抑制剂只会使Km增大，而K型效应剂根据其是激活还是抑制，分别使S 0. 5降低和升高。只影响Vm的效应剂称为V型效应剂，它们与非竞争性抑制剂的效应相似；非竞争性抑制剂只会使Vm下降，而V型效应剂根据其是激活还是抑制，分别使Vm升高和降低。,4别构酶的通性, 由多个亚基组成，亚基可以是同种或异种。 有调节部位和催化部位。 可结合多个配体。 配体的结合有协同效应，一分子配体与酶结合后使酶的构象改变，从而影响下一分子配体的结合。 根据CI值或n值可鉴别协同效应的类型。 其V对S的
13、曲线不是双曲线，而是S形曲线（正协同）或“表观双曲线”（负协同）。,三、别构机制的模式,1Hill模式 2Adair模式 3MWC模式 4KNF模式,1Hill 模式,Hill模式是Hill在1909年提出来的，当时是试图解释O2与血红蛋白结合的S形曲线的，后来用于别构酶反应中。以下是求Hill系数n值（协同系数）的方法：,式中,设酶被底物饱和的分数为 ，则,求n值的方法,由得,将代入得,求n值的方法,，,，, ，代入式得,求n值的方法,以 对 作图，可得一直线，其斜 率为n，纵轴截距为 ，横轴截距为lg S 0. 5 。,求n值的方法,当S过高或者过低时（S S0.9或 S S0.1），n常
14、等于1，故在一个广泛的S范围内作图时，得到的是折线。,n值与底物结合位点数的关系,Hill模式忽略了ES，ES2，ESn-1等形式的存在，由于协同效应和前述忽略不饱和结合形式的影响，根据Hill作图计算出来的n值往往小于酶对底物的结合位点数，Hb（hemoglobin，血红蛋白）上有4个O2结合位点，但计算的结果是n2.62.8。在负协同效应中，每分子酶也结合n个底物，但计算的结果却是n 1。所以Hill系数只能作为鉴别协同性的指标。,2Adair模式,Adair模式允许有稳定的未被底物饱和的ESx复合物存在。对于一个有4个底物结合位点的酶，有,其中K1、K2、K3、K4实际上是微观或内在解离
15、常数（microscopic or intrinsic dissociation constants），如果4分子底物是分别结合在四聚体酶的4个亚基上，则4个表观解离常数（apparent dissociation constants）为：,微观解离常数与表观解离常数的关系,取上面第二式证明如下：,Adair 模式的速度方程,将5种酶存在形式的浓度表达式代入式得,分子分母同乘以 得,如果酶分子中4个底物结合位点是相同的，并且它们之间没有相互作用，无协同性，则内在解离常数K1= K2= K3= K4，可用Ks统一表示它们，因此,将这4个表达式代入式得,分子分母同除以 得,分子分母同除以 得, ，
16、 ，,与米氏方程相同。 如果每一底物结合位点的内在解离常数不同时，就会出现协同性。K1 K2 K3 K4是正协同性，K1 K2 K3 K4是负协同性。, ， 时 ，即 余相似， , 在这些条件下就会导致正协同性。同理可得出负协同性的关系式。,Adair 模式正负协同性的判断,3MWC模式,1965年，Monod，Wyman和Changeux提出了一个根据酶的构象变化来说明协同效应的分子模式，MWC模式即以他们3人的姓缩写命名。根据此模式的特点，又称为齐变模式（concerted model）。此模式规定了以下几点： 别构酶是寡聚酶，由同种亚基组成，这些亚基称为原体（protomer），它们在寡
17、聚体中占有均等的地位。 一个原体对一种配体只有一个结合位点。,MWC模式的规定, 原体有两种构象状态，分别为R型（relaxed，松弛态）和T型（tensed，紧张态），这两种状态在与底物的亲和力、对别构效应剂的反应、催化活力方面可以不同，同一种状态的原体在这些方面是相同的。 在一个寡聚体中，所有的原体均处于同一种构象。各原体构象的转变是同步的，在一个寡聚体中，不存在R型和T型的杂合体。 R型和T型之间有一个转换平衡。,（1）底物同种协同效应（以4聚体为例）,MWC模式的速度方程,（推导略）,式中n等于一个寡聚体中的原体数，在上例中n4。,设 ， ，则 。,讨 论, 当L无穷小时，体系中只有R
18、型， 。 当L无穷大时，体系中只有T型， 。 当 时， （两种内在解离常数相 等），,讨 论, 因为R型对底物的亲和力恒大于T型，所以 值不可能大于1，C可在01之间取值。当C = 1时无协同效应；当C = 0时正协同效应最大。C越小正协同效应越大。 L越大正协同效应越大。,MWC模式的Ys对作图,（不同C值）,MWC模式的Ys对作图,（不同L值）,某些别构酶（别构蛋白）的别构常数,（2） MWC模式的异种协同效应,假设底物优先与R型结合，别构激活剂A也优先与R型结合，则A的存在可使R和T之间的平衡偏向R型，即L值降低，提供更多的R型供底物结合用，使Ys上升，表现出激活效应，同时底物正协同效应
19、减弱。如果A与R型的结合不改变R型的催化效应，也不改变KR，则A为K型激活剂。,MWC模式的异种协同效应,相反，K型抑制剂I优先与T型结合，使L值上升，T型增加，Ys降低，表现出抑制作用，同时底物正协同效应增强。 如果KR = KT，但R型有较高的催化效率，则与R型结合的A成为V型激活剂，与T型结合的I成为V型抑制剂。 MWC模式没有能够解释负协同效应。,4KNF 模式,1966年，Koshland，Nemethy和Filmer对Adair模式进行了扩展，提出了KNF模式，根据此模式的特点，又被称为序变模式（sequential model）。其要点如下： 在底物或效应剂不存在时，酶的各个原体
20、以同一种构象存在。,KNF 模式的要点, 当底物与一个原体结合后，可引起此原体构象的变化，同时使邻近的原体改变对底物的亲和力；第二分子底物与第二个原体结合后，使第二个原体构象发生改变，同时又影响了剩余原体对底物的亲和力。,K1K2K3K4（内在解离常数）为正协同效应，K1K2K3K4为负协同效应。,四、引起非双曲线动力学的其他现象,1酶的记忆现象 有些单体酶能表现出S形曲线，这也是因为别构效应引起的。1967年Rabin提出酶底物复合物能进行异构作用的机制来解释S形曲线。,ES必须先缓慢地异构成FS，然后快速地分解（break down）成F和P，F能够回复到E，也可以直接与S结合形成FS。,
21、return,酶的记忆现象引起S形曲线的机理,在低浓度S时，酶主要以E和ES形式存在，产物形成速度被缓慢的 异构化作用所限制。由于S低，F有较多的比例回复到了E，只有少量的F直接与S结合成FS。当S高时，有较多的F直接与S结合成FS，由于直接生成FS，避免了 这个限速步骤，所以大幅度地加快了反应速度，从而表现出S形曲线。,反应式,别构效应剂对记忆酶的影响,别构激活剂与E结合后可以提高异构化速率，别构抑制剂则降低异构化速率。别构效应剂通过影响k4及k1也会影响S形曲线的形状。,记忆酶举例,FS释放出产物后仍保持F构象可以认为是一种“记忆”现象。有记忆现象的酶称为记忆酶。记忆酶有单底物单产物的，也
22、有双底物双产物的。动物肝脏中的葡萄糖激酶和大麦胚中的己糖激酶都是典型的记忆酶。,2可引起正协同作用动力学曲线假象的其它因素, 酶不稳定，但高浓度底物能稳定酶。 底物和激活剂形成复合物，如ATP-Mg2+，当ATP与Mg2+ 以1:1混合后以不同的量加到反应体系中，则加的量增加1倍，ATP-Mg2+ 增加不止1倍。 酶含有可与底物可逆结合的杂质，与杂质结合的底物不能作酶的底物。在低S时，有较大比例的S与杂质结合，而在较高S时，与杂质结合的S比例下降，所以表现出正协同假象。,可引起正协同作用动力学曲线假象的其它因素, 随机机制的双底物反应,如果EEAEAB途径快于EEBEAB途径，则当A或B有一种
23、饱和时，V对另一种底物浓度的关系约为双曲线。但如果是B低于饱和浓度（A不行），则V对A的关系为S形曲线， 因为在A很低时，E主要与高浓度的B结合，使反应主要走EEBEAB这条慢途径，整个反应速度较慢；随着A的增加，快途径占的比例越来越大，使反应速度迅速增加，从而表现出S形曲线。,可引起正协同作用动力学曲线假象的其它因素, 酶对底物有极高的亲和力 如果酶与底物结合非常紧密，为了测定动力学参数，往往要使用较低的底物浓度，即S不特大于E（因为底物浓度不太高时，酶就处于被底物饱和的状态，为零级反应，没有变化，所以无法测定动力学参数）。在这种条件下 不能约等于 。,可引起正协同作用动力学曲线假象的其它因
24、素, 酶对底物有极高的亲和力 其双倒数方程为：,双倒数作图会表现出假的正协同现象。如果酶反应速度很慢，需要使用较高浓度的酶时，也会造成这种现象。,3可引起负协同作用动力学曲线假象的因素, 非酶催化反应的干扰 如果在酶催化反应的同时，还有一种非酶催化反应存在，其速率也与S成正相关，则在S大到一定程度，酶反应速度已达到Vm，而非酶催化反应仍,可随着S增加而反应速度增加。当S趋向于无穷大时，V也趋向于无穷大。因此双倒数作图是一条向下弯曲的通过原点的曲线，呈现出假的负协同曲线。,可引起负协同作用动力学曲线假象的因素, 两个酶催化同一反应 如果体系中有两个Km值不同的酶催化同一反应（两个同工酶或一部分酶被修饰后未完全失活，但改变了其Km），则观察到的V可由这两个酶反应的速度之和来表示。,可引起负协同作用动力学曲线假象的因素, 两个酶催化同一反应,当 合适时， 可得出负协同曲线的假象。当 ， ， 时，可得右图。,其双倒数方程为,