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1、HPLC测定五味子不同炮制品及不同部位有机酸的策略分析津伤口渴、内热消渴、心悸失眠等【1】。五味子常见的炮制品种有醋五味子、酒五味子。传统中医理论认为五味子入补药熟用,入嗽药生用;【2】,即五味子生熟异用;。五味子中含有木脂素、挥发油、多糖及有机酸等成分【3】。目前对五味子炮制前后活性成分木脂素含量变化的研究较多,但研究结果不尽相同,有报道五味子经炮制后木脂素含量有所增加,亦有研究表明,炮制后木脂素含量降低或无明显变化【6】,尚不能合理地解释炮制原理。因此,笔者对五味子炮制前后进行了全成分研究,以期从化学成分角度解析五味子的炮制原理,为临床合理用药提供依据。现就五味子不同炮制品及不同部位中的有
2、机酸含量比较研究报道如下。1仪器与试药Waters高效液相色谱仪(Waters e2695泵、Waters2998检测器,Empower3数字处理软件), KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗器械有限公司),METTLER AE240型十万分之一分析天平(瑞士METTLER),FA1004B电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。五味子购自丹东大梨树五味子GAP基地,经辽宁中医药大学药学院王冰教授鉴定为五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.的干燥成熟果实。原儿茶酸对照品(110809-201205)
3、、柠檬酸对照品(111679-200401)均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯,水为娃哈哈纯净水,其他试剂均为分析纯。2方法与结果2.1五味子不同样品的制备生五味子：原药材,除去杂质及果柄,洗净,干燥。醋五味子：生五味子加米醋(五味子米醋10020)拌匀,闷润1.5 h,蒸制5 h,50 干燥至恒重。酒五味子：生五味子加黄酒(五味子黄酒10020)拌匀,闷润1 h,蒸制4 h,50 干燥至恒重。五味子果肉、种仁：取生五味子,加少量水拌匀,润透,分离种仁和果肉,分别备用。2.2原儿茶酸含量测定2.2.1色谱条件Ecosil C18-AQ色谱柱(250 mmx4.6 mm,5 &mu
4、;m),LBG-C18保护柱(柱芯3 mmx4.6 mm),流动相为甲醇-0.5%冰醋酸(1585),检测波长260 nm,流速0.8 mL/min,进样量10 μL,柱温30 。色谱图见图1。2.2.2对照品溶液的制备精密称取原儿茶酸对照品3.66 mg,置5 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,配制成0.732 mg/mL的原儿茶酸对照品溶液,放入4 冰箱中保存,备用。2.2.3供试品溶液的制备取生五味子粉末(过60目筛)约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,密塞,称定质量,加热回流2 h,放冷,密塞,再次称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,
5、取续滤液,经0.45 μm微孔滤膜滤过,即得【7】。AB注：A.对照品；B.供试品图1五味子中原儿茶酸HPLC图2.2.4线性关系考察精密吸取上述对照品0.1 mL置25 mL容量瓶中,配制成浓度为0.002 928 mg/mL的原儿茶酸对照品溶液,分别进样2、6、10、15、20 μL,按2.2.1;项下色谱条件进行测定,以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程Y4 247 778.710X292.858,r0.999 9。结果表明,原儿茶酸对照品在0.005 90.058 6 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。2.2.5精密度试验精密吸取
6、原儿茶酸对照品溶液10 μL,重复进样6次,测定原儿茶酸的峰面积,RSD0.44%,表明精密度良好。2.2.6稳定性试验精密吸取生五味子供试品溶液10 μL,分别在0、2、4、6、8、10 h进样测定,结果原儿茶酸峰面积的RSD2.45%,表明供试品在10 h内保持稳定。2.2.7重复性试验取生五味子粉末6份,各0.5 g,精密称定,按2.2.3;项下方法制备供试品溶液,测定并计算含量,结果原儿茶酸含量的RSD2.16%。2.2.8加样回收率试验取已知含量的生五味子粉末0.25 g,共9份,3份为1组,分别精密加入0.732 mg/mL原儿茶酸对照品溶液20、40、60 μL
7、,按2.2.3;项下方法制备,并按2.2.1;项下色谱条件测定,结果见表1。2.3柠檬酸含量测定2.3.1色谱条件Ecosil C18-AQ色谱柱(250 mmx4.6 mm,5 μm),LBG-C18保护柱(柱芯3 mmx4.6 mm),流动相为乙腈15 mmol/L磷酸二氢钾缓冲盐溶液397(磷酸调pH3),检测波长为210 nm,流速为1.0 mL/min,进样量5 μL,柱温35 。色谱图见图2。表1原儿茶酸加样回收率试验取样量(g)样品中含量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0.257 60.025 20.014 60.039 3
8、96.580.254 40.024 90.014 60.039 297.950.251 80.024 70.014 60.039 097.950.253 90.024 90.029 30.053 798.290.251 70.024 70.029 30.053 798.9898.010.850.253 60.024 90.029 30.053 998.980.254 30.024 90.043 90.067 797.490.250 90.024 60.043 90.068 098.860.251 90.024 70.043 90.067 397.04AB注：A.对照品；B.供试品图2五味子中柠
9、檬酸HPLC图2.3.2对照品溶液的制备精密称取柠檬酸对照品13.8 mg置10 mL容量瓶中,加水溶解至刻度,配制成浓度为1.38 mg/L的柠檬酸对照品溶液,放入4 冰箱中保存,备用。2.3.3供试品溶液的制备 取生五味子粉末(过60目筛)约0.25 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入30%甲醇25 mL,密塞,称定质量,超声提取(功率250 W,频率30 kHz)40 min,放冷,密塞,再次称定质量,以30%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液10 mL回收溶剂至干,再以水溶解定容至10 mL,经0.45 μm微孔滤膜滤过,即得【7】。2.3.4线性关系考察分别进样1、3
10、、5、7、9 μL柠檬酸对照品溶液,按2.3.1;项下色谱条件测定,以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程Y72 411X16 223,r0.999 9。结果表明,柠檬酸在1.3812.42 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。2.3.5精密度试验精密吸取柠檬酸对照品溶液5 μL,重复进样6次,测定柠檬酸的峰面积,RSD0.48%,表明精密度良好。2.3.6稳定性试验精密吸取生五味子供试品溶液5 μL,分别在0、2、4、6、8、10 h进样测定,结果柠檬酸峰面积的RSD1.68%,表明供试品在10 h内保持稳定。2.3.7重复性试验精密
11、称取生五味子粉末6份,各0.5 g,按2.3.3;项下方法制备供试品溶液,测定并计算含量,结果柠檬酸含量的RSD2.16%。2.3.8加样回收率试验取已知含量的生五味子粉末0.1 g,精密称定,共9份,以3份为1组,分别按已知含有量的80%、100%、120%加入柠檬酸对照品,按2.3.3;项下方法制备,并按2.3.1;项下色谱条件测定,结果见表2。表2柠檬酸加样回收率试验取样量(g)样品中含量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0.103 315.318 712.027.168 798.750.102 415.185 212.027.119 299.4
12、50.105 715.674 612.027.384 297.580.105 115.585 615.030.269 197.890.106 315.763 515.030.562 698.6698.360.710.102 915.259 415.029.908 497.660.105 615.659 718.033.485 199.030.103 315.318 718.033.115 398.870.102 815.244 518.032.767 597.352.4样品含量测定取五味子不同部位及炮制品饮片,粉碎,过60目筛,分别按2.2.3;、2.3.3;项下方法制备供试品溶液,分别按2.
13、2.1;、2.3.1;项下色谱条件测定,记录峰面积,根据标准曲线计算样品中原儿茶酸和柠檬酸的含量,结果见表3。表3五味子不同炮制品及不同部位中有机酸含量测定结果(%,n3)样品原儿茶酸柠檬酸总含量生五味子0.009 814.829 314.839 1酒五味子0.012 414.169 414.181 8醋五味子0.012 114.365 014.377 1五味子果肉0.012 322.881 022.893 3五味子种仁0.009 03.899 03.908 03讨论中药炮制后,由于加热、加辅料等处理,无疑会使其化学成分发生一系列变化,某些成分可能增加,某些成分可能减少,也可能产生新的成分。中
14、药的化学成分是临床作用的物质基础,所以研究中药炮制前后化学成分的变化,对探讨中药炮制作用和原理具有重要意义。本研究以甲醇-0.5%冰醋酸为流动相,选用不同比例(2575、2080、1585)、不同流速(0.6、0.8、1.0 mL/min)进行多次试验,结果表明,甲醇-0.5%冰醋酸比例为1585、流速为0.8 mL/min时,原儿茶酸与其他组分分离良好。选用乙腈-15 mmol/L磷酸二氢钾缓冲盐溶液为流动相测定柠檬酸含量,改变流动相比例(397、298、199)及柱温进行比较研究,结果表明,乙腈-15 mmol/L磷酸二氢钾缓冲盐溶液比例为397、柱温35 时,柠檬酸色谱峰峰形较好。本试验
15、比较了五味子不同炮制品和不同部位有机酸含量的差异,结果显示,五味子中有机酸含量较高,且果肉中含量最高,约为种仁的6倍,与五味子的皮肉甘酸,核中辛苦;相吻合。原儿茶酸和柠檬酸均可抑制血小板聚集,原儿茶酸还有抗氧化的作用,五味子炮制后原儿茶酸含量明显增加,可能是五味子入补药熟用;的物质基础之一。参考文献：【1】 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部.北京：中国医药科技出版社,2010：61-62.【2】 李时珍.本草纲目.张守康主校.北京：中国中医药出版社,1998：534.【3】 郑占虎,董泽宏,佘靖.中药现代研究与临床应用.北京：学苑出版社,l997：148.【4】 田建红.不同炮制方法对五味子中木脂素类成分含量的影响.药学进展,2009,33(6)：267-270.【5】 秦凤莲.HPLC法测定五味子炮制品中3种木脂素类成分的含量.临床和实验医学杂志,2009,8(2)：39-40.【6】 田芳,窦德强,程大任,等.五味子生品、炮制品不同部位木脂素类成分的含量.中国现代中药,2007,9(9)：7-8.【7】 李丽,肖永庆,于定荣,等.HPLC测定五味子中3种有机酸的含量. 中国中药杂志,2011,36(23)：3286-3289. 张秀丽,李亚晨,牛新华,等.原儿茶酸对帕金森模型鼠脑组织抗氧化能力的影响.现代生物医学进展,2011,11(17)：3248-3251.