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1、RNAi下调FAK基因对大肠癌细胞SW620侵袭及转移能力的影响【摘要】 目的 观察应用RNAi技术下调局部粘着斑激酶（FAK） 基因表达对SW620细胞侵袭及转移能力的影响。方法 利用前期构建的针对FAK基因有效的短发夹RNA （shRNA ）序列的慢病毒表达载体， 包装慢病毒并感染人结肠癌细胞SW620。运用免疫印记（Western-blot）从蛋白水平检测FAK基因的表达， Transwell小室模型分别检测敲减FAK基因表达对SW620细胞的侵袭及转移能力的影响。结果 用慢病毒敲减FAK后的大肠癌细胞， 蛋白水平FAK表达明显下调， SW60细胞的侵袭及转移能力均受到明显抑制。结论 下
2、调FAK的表达水平， 能明显抑制大肠癌SW620细胞的侵袭及转移能力。【关键词】 慢病毒；局部粘着斑激酶；SW620；人结肠癌细胞；短发夹RNADOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.14.212Influence by RNAi down-regulated FAK gene on invasion and metastasis ability in colorectal cancer cell SW620 MAO He-hui， CHEN Yan-hong， SU Guo-qiang. Department of Surgery， Xiamen City Matern
3、al and Child Health Care Hospital， Xiamen 361003， China【Abstract】 Objective To observe influence by RNAi down-regulated focal adhesion leinase （FAK） gene on invasion and metastasis ability in colorectal cancer cell SW620. Methods Lentivirus packaging was made by expression vector of short hairpin RN
4、A （shRNA） sequence established for FAK gene， and human colon cancer cell SW620 was infected. Western-blot was applied to detect FAK gene expression from protein level， and Transwell cell model was used to detected influence by FAK gene knock-down expression on invasion and metastasis ability in SW62
5、0. Results In colorectal cancer cell after FAK gene knock-down by lentivirus， protein FAK expression was reduced， while invasion and metastasis ability in SW620 were obviously suppressed. Conclusion Invasion and metastasis ability in colorectal cancer cell SW620 can be remarkably suppressed by down-
6、regulated FAK expression.【Key words】 Lentivirus； Focal adhesion leinase； SW620； Human colon cancer cell； Short hairpin RNA大肠癌主要以手术和化疗治疗， 但是对复发转移患者， 传统治疗疗效较差， 近年来， 靶向治疗成为研究热点。FAK作为细胞传导中的重要信号分子， 参与细胞增殖、转移， 如果可以抑制FAK基因的表达， 理论上能降低肿瘤的增殖活性、侵袭及转移能力。既往研究提示， 抑制细胞内FAK基因表达， 可明显降低乳腺肿瘤及卵巢肿瘤细胞的侵袭和转移能力 。前期试验中成功构建了
7、FAK shRNA重组慢病毒质粒， 并制备相应的慢病毒感染人大肠癌细胞SW620【3】， 下调其FAK基因表达， 观察对大肠癌细胞SW620侵袭、转移能力的影响， 为动物体内实验打下基础。现报告如下。1 材料与方法1. 1 材料 人大肠癌细胞株SW620由厦门大学李博安教授惠赠；Tranwell小室购自Millipore公司；Trizol、Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；RNase-free购自大连宝生公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清等购自Hyclone公司；细胞培养板及计数板均购自Costar公司。1. 2 方法1. 2. 1 细胞培养及转染West
8、ern blot法检测FAK蛋白表达 实验分为1组感染表达FAK-shRNA（实验组）， 2组感染无关序列shRNA， 3组正常SW620细胞。病毒感染后2 d的细胞中提取各组等量蛋白， 将蛋白转到PVDF膜， 使用已制备的封闭液室温封闭1 h。用一抗在4下与PVDF膜孵育过夜。TBST洗膜3次， 加入与一抗相对应的二抗， 在摇床上室温孵育1 h。TBST洗膜3次， 然后显色、摄影。1. 2. 2 细胞侵袭、转移实验 Transwell小室制备：包被基底膜：用50 mg/L Matrigel稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面， 4风干。水化基底膜：吸出培养板中残余液体， 加入50
9、μl/孔含10 g/L BSA的无血清培养液， 37， 30 min。制备细胞悬液：消化细胞， 终止消化后离心弃去培养液， PBS洗2次， 用含BSA的无血清培养基重悬， 调整细胞密度至5x104个/ml。接种细胞：取细胞悬液1 ml加入Transwell小室。6孔板下室加入2 ml含10%FBS的培养基。37、5%CO2条件下继续培养24 h。穿膜细胞计数：取出Transwell小室， 用棉签擦去Matrige胶和上室内的细胞， 0.1%结晶紫染色1 h， 双蒸水冲洗Transwell小室膜， 然后将其解下， 反面贴于载玻片上， 倒置显微镜下计数， 100倍下取5个视野， 计数后取平均
10、值。1. 3 统计学方法 采用SPSS14.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P0.05）。见图2。图2 敲减FAK基因表达抑制SW620细胞的侵袭能力3 讨论肿瘤发生侵袭、转移是一个多基因参与的复杂的多步骤过程。在肿瘤转移过程中， 肿瘤细胞通过表达基质金属蛋白酶和乙酰肝素酶降解基底膜【4】， 这需要通过复杂的细胞信号转导来实现。RNAi是一种基因沉默技术， 目前广泛应用于肿瘤研究领域， 其作用机制：核酸内切酶（Dicer）将DsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约2123 bp）， 即siRN
11、A， 然后siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链， 反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC）。由RISC介导切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域， 从而达到干扰基因表达作用。FAK通过调控细胞周期来促进肿瘤细胞增殖【5】。有研究显示， 主要有3条信号传导通路共同作用于FAK， 然后再通过一系列信号传导， 诱导周期素D1和周期蛋白依赖性蛋白激酶高表达， 由此加快细胞从G1期进入S期， 促进细胞增殖 【6】， 这三条通路包括：FAK-Ras-M
12、APK；FAK-P130cas-Crk-JNK-C-Jun；FAK-PI3K-AKT通路。Lin 【7】研究发现沉默FAK基因， 抑制FAK-P130cas-Crk-JNK-C-Jun信号通路， 使正常鼠的成纤维细胞NIH3T3停滞在G1， 无法进入S期， 明显影响该成纤维细胞的生长。Sonoda等下调黑色素瘤细胞FAK基因表达， 抑制FAK-PI3K-AKT信号通路， 降低细胞周期蛋白D1和周期蛋白依赖性蛋白激酶4表达， 明显抑制黑色素瘤细胞增殖。FAK在肿瘤细胞的侵袭和转移中扮演着重要角色。其是细胞信号传导通路中的上游因子， 主要通过以下3条信号传导通路促进细胞侵袭、转移：FAK/Src信
13、号传导通路。FAK/PI3K信号通路。FAK/Rho信号传导通路。Hauck 等研究表明沉默FAK基因， 可抑制上述3条信号传导通路， 发现其研究的肿瘤细胞侵袭能力明显下降。Su 等应用RNA干扰技术， 沉默胃癌SGC7901细胞FAK基因， 抑制胃癌细胞SGC7901增殖、侵袭和转移， 同时可以抑制动物体内胃癌生长， 减低远处转移的风险。Egawa等下调FAK表达水平， 成功抑制膀胱癌细胞侵袭、转移等能力。本项研究的结果也表明下调FAK基因的表达水平， 大肠癌细胞SW620侵袭及转移能力明显下降， 这将为今后大肠癌的靶向治疗提供新的靶点。总之， 利用前期构建的pLentilox3.7-shF
14、AK， 制备相应的病毒， 感染大肠癌细胞SW620， 能明显下调其FAK的表达， 从而有效抑制SW620的侵袭及转移能力， 为后续的实验打下基础。参考文献【1】VM Golubovskaya， Zheng M， Zhang L， et al. The direct effect of focal adhesion kinase （FAK） dominant-negative FAK， FAK-CD and FAK siRNA on gene expression and human MCF-7 breast cancer cell tumorigenesis. BMC Cancer， 2009（9）：280.【2】Halder J， Landen CN Jr， Lutgendorf SK， et al. Focal adhesion kinase silencing augments docetaxel-mediated apoptosis in ovarian cancer cells. Clin Cancer Res， 2005， 11（24 Pt 1）：8829-8836.