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1、Shp2蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义摘要：目的：研究乳腺癌标本中Shp2（一种含有SH2结构域的酪氨酸蛋白磷酸酶）的表达，及其与乳腺癌雌激素水平（E2），泌乳素（PRL）的表达情况及淋巴结转移状态之间的关系。方法：采用Western印迹法检测Shp2在乳腺癌组织中的表达，采用放射免疫分析法（RIA法）检测血清E2的表达，采用一步酶免法检测血清中PRL的表达，分析Shp2在乳腺癌组织中的表达程度及其与E2、PRL、淋巴结转移之间的关系及与相关临床资料进行分析。结果：Shp2蛋白在乳腺癌组织中有高表达，有淋巴结转移的患者的乳腺癌组织中Shp2表达明显高于无淋巴结转移的患者，同时E2与Shp2的表
2、达之间有相关性，随着血清中雌激素表达的升高，乳腺癌组织中Shp2的表达也不断升高。结论：Shp2蛋白在乳腺癌组织中呈现高表达，与血清中E2的表达呈正相关关系，与血清中PRL的表达无相关关系，Shp2蛋白在乳腺癌中的表达可作为新型肿瘤标记物用于乳腺癌诊断以及转移风险评估的指标之一。关键词：乳腺癌；Shp2蛋白乳腺癌是西方国家女性中最常见的恶性肿瘤，近年来在我国，乳腺癌的发病率呈迅速上升趋势，经过多年努力，医学界在乳腺癌的早期检测和治疗方法上取得了长足的进步。利用Western印迹法检测30例乳腺癌组织中Shp2的表达，分析其与血清中E2、PRL表达的相关性，现报告如下。 1 资料与方法1.1一般
3、资料：选取2008年5月2009年10月间在苏州大学附属第三医院常州市第一人民医院乳腺外科住院患者，均经术后病理确诊，共30例，年龄4075岁，平均57.5岁。肿瘤位于左乳14例，位于右乳16例；其中乳腺浸润性导管癌26例，浸润性小叶导管复合癌2例，乳腺浸润性微乳头状癌1例，乳腺浸润性小叶癌1例；无淋巴结转移11例，有淋巴结转移19例。1.2主要试剂：Access E2试剂盒、Access E2定标品（S0S5）、Access PRL试剂盒、Access PRL定标品（S0S5）、定标卡、Access底物、Access冲洗缓冲液、Access样品稀释液均购于浙江宁波海尔斯公司，使用仪器为美国贝
4、尔曼公司生产的DxI-800全自动化学发光免疫分析仪，余试验材料及试剂均取自苏州大学附三院。1.3试验方法：采用Western印迹法检测Shp2在乳腺癌组织中的表达，采用放射免疫分析法（RIA法）检测血清E2的表达，采用一步酶免法检测血清中PRL的表达。1.4统计学方法：用SPSS 16.0软件包处理数据。计量资料经过正态检验和方差齐性检验，数据以均数标准差（）表示，采用t检验（Independent sample T test），计数资料采用2检验，两组变量间的相关分析采用曲线拟合，以P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1Shp2在乳腺癌组织和癌旁组织的表达：Shp2在乳腺癌组织和癌旁
5、组织中均有不同程度的表达。结果发现：同一患者乳腺癌组织中Shp2表达明显高于癌旁组织中的表达，乳腺癌组织中Shp2表达量为0.69670.4180，乳腺癌旁组织中Shp2表达量为0.22070.2150，两者表达差异有统计学意义（P0.01），见图1。注：系列1表示癌组织，系列2表示癌旁组织图130例Shp2磷酸酶在癌及癌旁组织表达的定量分析2.2乳腺癌组织中Shp2的表达与乳腺癌临床病理特征的关系：按不同年龄、肿瘤直径、病理类型及淋巴结转移分组，单因素分析表明：11例无淋巴转移的乳腺癌组织中Shp2表达量为0.62300.4793，19例有转移的Shp2表达量为0.77040.3472，差异
6、有统计学意义（P0.05），乳腺癌组织中Shp2的表达仅与淋巴结转移有相关性。2.3乳腺癌组织中Shp2的表达与血清中E2、PRL的相关性：见图23。注：曲线方程式为Shp2=32.981+107.280 E2-48.309 E22图2乳腺癌组织中Shp2与血清中E2的相关关系的曲线拟合注：乳腺癌组织中Shp2与血清中PRL的表达无明显的相关性图3使用SPSS软件对乳腺癌组织中Shp2与血清中PRL表达的分析3 讨论Shp2是第一个确定的具有磷酸酶活性的促肿瘤蛋白，由PTPN11基因编码，属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一员，是一种含有SH2结构域的酪氨酸蛋白磷酸酶，上个世纪90年代由几个试验小组
7、各自通过克隆的方法发现，分别命名为PTP1D、SH2PTP3、SH2PTP2以及Syp。它可以通过蛋白质之间的相互作用精确地被定位到细胞信号传导途径当中的适当位置，调控相应蛋白质的磷酸化状态，从而参与细胞内的信号调控。除了作为一种原癌基因，Shp2在多种促癌信号通路当中起着重要的作用【4】。Shp2通过SH2功能域结合到酪氨酸磷酸蛋白质，使PTP酶激活，从而作为下游信号分子参与信号转导，调节细胞增殖、分化、迁移、死亡等，是细胞因子、抗原、细胞外基质等的下游信号分子【1】。Shp2与其他分子中磷酸化的酪氨酸残基的结合，从而指导由酪氨酸磷酸化所启动的信号转导级联反应中的这两种磷酸酶的特异性蛋白与蛋
8、白之间的相互作用。本研究运用Western印迹法检测分别检测了乳腺癌组织和乳腺癌组织中Shp2的表达量，结果显示乳腺癌组织中Shp2表达量为0.69670.4180，乳腺癌旁组织中Shp2表达量为0.22070.2，乳腺癌旁组织中Shp2的表达明显低于乳腺癌组织中的表达，两者差异有统计学意义（P0.05）。而此前的研究发现Shp2在正常乳腺组织表达量低，但在乳腺癌患者和乳腺细胞株表达差异有统计学意义（P0.05），因此，乳腺肿瘤组织的Shp2蛋白差异检测是检测乳腺癌的重要指标。本研究发现乳腺癌组织中Shp2的表达在按淋巴结转移分组中差异有统计学意义（P0.05），有淋巴结转移的患者的乳腺癌组织
9、中Shp2表达明显高于无淋巴结转移的患者的乳腺癌组织中Shp2表达，这与相关研究表明Shp2与乳腺癌淋巴结转移有相关性相符。探其原因，Shp2与乳腺癌淋巴结转移的相关性可能与Gab2（Grb2相关结合蛋白2）的表达相关。EGFR（表皮生长因子受体家族）在乳腺癌发生与转移过程中起着关键作用，Gab2是EGFR下游关键信号介导蛋白。目前大量研究发现EGFR激酶可以通过磷酸化途径激活Gab2分子，并促使Gab2分子直接与原癌基因Shp2酪氨酸磷酸酶结合，参与调控乳腺癌生长、癌细胞迁移与黏附。最新研究发现Gab2是细胞膜表面丝状伪足复合体形成所必须，而伪足形成直接调控了癌细胞的迁移。Wang等对MCF
10、-7乳腺癌细胞的研究中发现，野生型Shp2通过降低E2钙黏蛋白的表达可导致细胞连接的破坏，从而降低细胞间及细胞与基质间的黏附性；通过增强金属蛋白酶MMP-1和MMP-9的分泌，可降解细胞外多种胶原及基质，为细胞移动提供有利条件。Herrera等研究发现，IL-1 介导的成纤维细胞在局部的黏附，依赖于Shp2第542位上的酪氨酸残基，它与Gab1的结合，可能是激活下游ERK信号转导通路的原因。Tsutsumi等对胃上皮细胞的研究中发现，黏着斑激酶（Focal adhesion kinase，FAK）在细胞迁移过程中处于去磷酸化和磷酸化的动态循环中，Shp2突变致使FAK磷酸化循环中断，同样FAK
11、 去磷酸化也被减少，导致细胞黏附性增高与移动性降低。乳腺癌是激素依赖性肿瘤，雌激素、泌乳素等性激素在乳腺发育、增生、退缩等生理过程以及癌变与演进各病理阶段均起着重要作用，雌激素通过与其特异性受体的结合行使功能。乳腺癌发病年龄的分布曲线30岁以下的病例少见，从30岁开始乳腺癌的发病率开始上升，高峰年龄在4050岁之间，而在绝经后510年亦有一个小高峰，在女性绝经期前后会出现一段迟滞的走势，这个现象强烈提示女性体内雌激素及其水平在乳腺癌的发生中扮演重要角色。研究发现，绝经后妇女中患乳腺癌者较健康女性体内总雌激素水平平均高出15%24%。Gab2是一种锚定蛋白，能够介导Shp2在细胞中的定位，调控S
12、hp2酪氨酸磷酸酶活性的发挥。Gab2在乳腺癌细胞，尤其是雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系中也存在过表达现象，而在MCF-7中研究结果更是证明了雌激素能够直接诱导Gab2的表达。这些研究结果提示，在乳腺癌细胞当中，雌激素可能具有促进Shp2/Gab2表达的作用。雌激素可能通过上调Shp2蛋白的表达量，加强一些RTK或细胞因子受体下游信号通路的活性，从而加强雌激素对于乳腺癌细胞的影响。另一方面，Shp2能够参与细胞内多种涉及细胞生长的信号通路的调节，其活性与细胞生长具有重要联系。而雌激素是促进乳腺癌细胞生长中最重要的因素。有试验结果表明，Shp2维持正常的活性，在雌激素促进MCF-7以及Bcap-3
13、7细胞生长的过程中起着重要作用。Shp2活性的抑制，能够降低在雌激素受体阳性细胞中，雌激素对于细胞生长的促进作用。这就提示我们，Shp2活性抑制剂将有可能发挥类似他莫昔芬的作用，有益于阻止乳腺癌的继续发展及术后复发等。这可能为乳腺癌预防与治疗药物提供了新的研究靶点。在雌激素的细胞质信号调控机制中，ER受到雌激激活后会在Shc的介导下与IGF-IR结合，从而向下游传递信号，激活MAPK号通路。另一项可以佐证这个理论的研究是，IGF在雌激素刺激存在的情况下可以大大地提高其促进细胞增殖的作用。Shp2可能通过在雌激素的刺激下与ER，IGF-IR形成复合物，从而参与到雌激素的细胞质内信号传导途径当中，
14、并有可能通过其表达量或活性的变化影响雌激素促细胞生长及基因的调控的作用。因此，我们认为乳腺癌的发生中可能存在着这样一种机制，那就是雌激素的刺激导致了乳腺正常细胞当中Shp2表达量的上升，而Shp2表达量的上升又可能促进了E2/IGF-IR/Shp2/Akt这样一条信号通路，并因此加强了雌激素对乳腺癌细胞的作用。这样的相互作用可能最终导致雌激素对于乳腺组织的正常调节作用被扰乱，并可能最终影响了乳腺癌的发生与发展。在本研究中，雌激素与Shp2的表达之间有相关性，由图2我们可以看到，我们可以根据两者之间的散点图明显绘制出回归曲线，并由此得出回归线方程：Shp2=32.981+107.280 E2-4
15、8.309 E22。根据曲线趋势我们明显可以判断随着血清中雌激素表达的升高，乳腺癌组织中Shp2的表达也不断升高，也就是说，雌激素确实能够在乳腺癌细胞当中显著促进Shp2的表达。动物实验及大量基础研究提示泌乳素对乳腺癌的发生有促进作用。但在本研究中，我们使用SPSS软件分析了乳腺癌组织中Shp2的表达与血清中PRL的表达（见图3），乳腺癌组织中Shp2与血清中PRL的表达无明显的相关性，这可能与样本量不足有关。我们希望在以后能不断增加样本量，以期得到相近的结论。综上所述，我们认为，乳腺癌组织中Shp2高表达，且与乳腺癌淋巴转移相关，乳腺癌组织中Shp2的表达与血清中E2的表达呈正相关关系，与血
16、清中PRL的表达无相关关系，Shp2蛋白在乳腺癌中的表达可作为新型肿瘤标记物用于乳腺癌诊断以及转移风险评估的指标之一。4 参考文献【1】 Neel BG,Gu H,Pao L.The Shp ing news:SH2 domain-containing tyrosine phosphatases in cell signaling.Trends Biochem Sci,2003,28(6):284.【2】 Barford D.Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosp
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