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1、实 验 九,蛋白质的诱导表达,9.1.1 实 验 目 的,掌握蛋白质诱导表达的原理 学习蛋白质诱导表达的方法 了解重组蛋白质表达的体系及其有缺点,外源基因的高效表达,获得有重要价值的蛋白质产品,需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其它载体,然后导入活细胞,基因工程的最终目的,主要步骤 制备表达载体 制备目的DNA 将目的DNA 克隆到载体上,操作 1. 酶切, 去磷酸化 2. 胶回收纯化 1. 质粒纯化/PCR 2. 酶切 3. 胶回收纯化 1. 目的片断与载体连接 2. 转化非表达型宿主菌 3. 筛选阳性克隆: 菌落PCR, 质粒提取酶,测序确定阅读框,蛋白表达操作流程,转化表达宿主菌 诱导优化
2、表达目的蛋白 纯化目的蛋白,1. 转化带有T7RNA 聚合酶基因 的菌株 1. 检测质粒稳定性 2. 确定表达时间和温度的最佳条件 3. 分析蛋白溶解性和活性 4. SDS-PAGE, Western 印迹等 确定目的蛋白 1. 放大培养 2. 制备粗提物 3. 亲和纯化 4. 切除融合标签并去除蛋白酶,蛋白质表达系统,原核表达系统,真核表达系统,大肠杆菌,枯草芽胞杆菌,YEAST,CELL CULTURE,INSECT CELL,TRANSFERRED GENE,简单,便宜,大量,无修饰,复杂,昂贵, 有修饰,大肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的
3、首选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用低，生产成本低廉。,9.1.2 原核表达的特点,细菌RNA聚合酶不能识别真核基因启动子 真核基因mRNA无SD序列，不能启动翻译 缺乏转录后加工系统，不能切除内含子, cDNA, 表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏 缺乏翻译后加工体系 不溶性的包涵体,在E.Coli中表达重组蛋白功能最强大 目的基因受噬菌体T7强转录及翻译信号控制 表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导 充分诱导: 几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白, 数小时后达细胞总蛋白的50%以上 非诱导条件下: 可使目的基因完全处于沉默状态而不转录,结构基因：编码-半乳糖苷酶（Z）、
4、透性酶（Y）和硫半乳糖苷乙酰转移酶（A）的基因。 操纵子：包括启动子、操纵基因和结构基因 调节基因、阻遏蛋白 乳糖+阻遏蛋白，改变阻遏蛋白的形状。,9.1.3 乳糖操纵子,9.1.4 诱导原核表达的原理,E.Coli BL21（DE3）：DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的噬菌体，其基因型为：lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5,lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源
5、基因大量转录并高效表达。,9.1.5 蛋白原核表达载体,具备与克隆载体相同的条件：自主复制序列，可供筛选的遗传性状，MCS 还必须具有用于外源基因表达的启动子、SD序列、及转录终止子等元件。 pET系列：6 His Tag （660Da-2kDa） pGEX系列：GST （26kDa） pMAL系列：Maltose Binding Protein （52kDa）,pET系列,pGEX系列,pMAL系列,9.1.6 融合蛋白,融合蛋白: 将两个或多个开放阅读框按一定顺序连接, 融合阅读框表达出一杂合蛋白 融合标签: 1. 保护目的蛋白使之不被降解 2. 用于检测和纯化目的蛋白 3. 增加目的蛋白
6、在细胞质中的可溶性 4. 帮助将目的蛋白运转到细胞周质中 以提高其生物活性,9.1.7 阅读框架的保证,pGEX系列,DNA转录和RNA翻译，即遗传信息从基因流向RNA又流向蛋白质的过程总称为基因表达,基因表达可以在不同的水平上进行调控，如控制基因的开启、关闭和活性的大小，影响和控制转录和翻译等都属于基因表达的调控。 影响转录水平的因素：强启动子，强终止子 等。 影响翻译水平的因素：SD序列，mRNA稳定性等。 影响蛋白质水平的因素：异源蛋白，易降解。,9.1.8 影响表达效率的主要因素,9.1.9 优化表达 （1）,增加蛋白质溶解性及折叠: 温度: 37 C 蛋白质以聚集的形式表达-包涵体
7、30 C 可溶的有活性的蛋白 细胞周质定位: 有利于蛋白折叠及二硫键的形成 稀有密码子: 多数氨基酸都有一个以上的密码子, 但有一些 E.Coli很少 使用, 当异源目的基因的mRNA过表达时, tRNA 的数量直接 反应密码子的偏倚性, 一个或多个tRNA的稀有或缺少会导 致翻译的停止 毒性基因和质粒稳定性: 抗生素的使用 补充葡萄糖,提高翻译水平： 调整SD序列与AUG间的距离、点突变改变碱基、增加mRNA稳定性 减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平： 细菌的生长和外源基因的诱导表达分开。 化学诱导，温度诱导。 提高蛋白质稳定性，防止降解。 表达融合蛋白，表达分泌蛋白（防止降解，减轻代谢负荷、
8、恢复天然构象）,9.1.9 优化表达 （2）,9.2.1 实验器材,1、基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-eGFP 每位同学（20ml菌液/三角瓶） 2、IPTG （乳糖结构类似物） 3、LB(Kanr) 4、离心机,9.2.2 实验步骤(1),原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中。 挑取单菌落于2mL Kan+ LB培养基培养过夜。（已做） 以5%的比例转接于20mL Kanr LB培养基中，培养约1小时至OD600=0.6，即可开始诱导目的蛋白的表达。 取1mL菌液,制样作为未诱导对照。 三角瓶中加入IPTG 40uL(0.5M)至终浓度为1mM，继续培养。,取样：分别于培
9、养后，30, 60，90, 120, 取1mL菌液制样。 制样： 12000rpm离心1min，去掉上清。 加入25uL ddH2O，重悬(充分分散细胞)。 加入25uL 2SDS凝胶加样缓冲液，混匀。 沸水浴5min(蛋白质变性)，取出后立即置于冰上。 冷却后，冰箱冷藏, 备用。,9.2.2 实验步骤(2),实验关键点,诱导和取样时要进行无菌操作。 制备样品时,细菌培养基上清除干净,且要充分悬浮。 每个时间点的样品要立即制样 并做好标记。,如何通过调节IPTG的浓度和温度来控制蛋白表达速度，从而提高蛋白的可溶性？,思 考 题,下 次 实 验,诱导表达蛋白的SDS-PAGE 电泳检测,开始工作吧！LETS BEGIN NOW！,