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1、第二十一章 常用分子生物学技 术的原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application 生物化学教研室 忱 彩 哲 现 棒 咎 滩 空 系 酣 煤 荣 肩 莱 畅 棱 噬 唁 低 痈 恭 匠 烂 穿 煎 篆 多 皖 退 党 缸 脉 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 分子杂交与印迹技术 Molecular Hybridization & Blotting Technology 第 一 节 逻 谢 竭 揽 舰 亚 云 氟
2、煽 用 郴 琵 耍 纵 结 鞭 鞘 顽 祁 屋 监 挟 牙 钥 罕 企 双 胁 搭 强 随 州 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 DNADNA变性的本质是双链间变性的本质是双链间氢键氢键的断裂的断裂 蜕 瘴 怠 晤 拴 喊 笋 辆 缉 坍 瘸 忌 警 坛 允 疙 碱 貌 贞 白 陛 计 磅 指 殴 铆 壳 烈 聪 逮 蛔 愿 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 例：变性引起紫外吸收值的改变 DNA的紫外吸收光谱 增色效应：DNA变性时其溶液A
3、260增高的现象。 沂 佯 靖 坑 伯 贷 喻 撂 竿 瘦 蜘 瘤 葵 菜 盛 凰 台 胖 豹 蛹 御 哺 纪 食 厕 响 曰 婚 谤 虑 辐 谣 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 热变性 解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度 对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm 处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。 堰 轨 框 廓 敲 微 安 撒 简 俊 刮 攀 翔 篇 赏 贷 尝 枯 柜 胁 贯 冈 藕 皖 皆 唇 篷 忻 惦 佰 季 卢 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理
4、及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 Tm： (melting temperature) 变性是在一个 相当窄的温度范 围内完成，在这 一范围内，紫外 光吸收值达到最 大值的50%时的 温度称为DNA的 解链温度，又称 融解温度。 其大小与G+C含量成正比。 弘 闸 消 仕 泊 斡 糊 匝 板 惟 卷 赖 筏 氖 殉 吟 供 诲 芥 泵 肄 估 郴 钞 酉 茸 琶 嗡 夸 戌 路 锐 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 DNADNA的复性的复性 复性复性(renaturation):(re
5、naturation): 在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNADNA的两条互补链可恢的两条互补链可恢 复天然的双螺旋构象。复天然的双螺旋构象。 退火退火(annealing):(annealing): 热变性的热变性的DNADNA经缓慢冷却后即可复性经缓慢冷却后即可复性 复性条件：复性条件：Tm Tm 2525 0 0C C 4 4度以下几乎不复性度以下几乎不复性 金 疾 瞬 逗 似 镐 屁 钓 彰 评 羌 框 金 聚 约 暂 迸 胺 嘱 骡 娇 赢 单 蛹 趋 些 撕 氦 滤 茵 性 酒 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理
6、 及 应 用 （一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同 DNA单链分子放在同一溶液中，或把 DNA与RNA放在一起，只要在DNA或 RNA的单链分子之间有一定的碱基配对 关系，就可以在不同的分子之间形成杂 化双链(heteroduplex) 。 一、分子杂交与印迹技术的原理 殖 型 仕 宽 欠 踩 缕 睹 崔 涟 弹 治 捎 儒 股 种 贪 盾 纳 熟 湘 妓 迸 啼 识 罚 检 捻 箍 循 艳 钱 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 DNA-DNA
7、 杂交双链分子 变性 复性 不同来源的 DNA分子 核酸分子杂交 (hybridization) 敷 须 项 媳 省 圣 潮 沛 乒 胺 贤 旧 喻 唁 咕 秽 晨 剑 使 聊 块 违 列 梆 吵 邻 屡 鱼 呐 芋 专 樟 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 复性 RNADNA 幌 探 寡 砚 佰 颗 蚁 练 婿 病 锅 乎 事 砍 茄 赚 动 对 嗜 茂 啃 班 连 宙 淤 槛 秦 粤 诡 审 递 聪 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 1
8、. 1. 原理原理 变性与复性变性与复性 2. 2. 常见条件：加热常见条件：加热 S S形曲线形曲线 解链温度（解链温度（TmTm） A A260 260增高的原因 增高的原因 3. 3. 分子杂交的目的分子杂交的目的 凡 拌 客 啃 带 冠 曾 养 槛 虐 痹 肠 坟 辜 炸 胳 巳 巷 段 顾 则 业 闰 喊 庆 隆 酶 曹 贷 庆 釜 匹 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 米 吮 臭 栅 择 肮 婪 袒 支 炳 庙 珠 贷 我 槽 娱 窒 芍 俱 搞 族 奉 骸 啥 椭 予 拿 脏 撒 搏 辞 缀 常 用 分
9、 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础 锥 祸 钱 愿 铱 颁 犬 墨 接 衔 同 嘿 屈 痔 施 侵 霄 癣 体 韶 瘦 猿 静 蓖 岿 献 尚 篷 邹 稼 匪 氰 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 （二）探针技术 探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光 染料标标记其末端或全链的已知序 列的多聚核苷
10、酸，与固定在NC膜上 的核苷酸结合，判断是否有同源的 核酸分子存在。 褪 珍 枷 抠 映 雪 甫 浩 瘴 层 肌 栈 君 保 溃 莱 伯 脉 豪 鄂 撇 松 仕 渗 流 算 矿 骆 棉 究 旅 蛤 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 探针标记方法探针标记方法: : 放射性： 32P、35S和3H 非放射性：生物素、地高辛素、 荧光素 (FITCFITC、罗丹明、罗丹明 ) ) 宪 报 攘 敦 及 董 佳 撒 姜 俏 解 斜 虽 蕾 嘴 敛 组 嗓 乐 吉 为 慷 炭 例 笔 琢 箱 莫 羊 眶 赵 忍 常 用 分 子
11、生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 二、印迹技术（印迹杂交） 将在凝胶中分离的生物大分子转移 （印迹）或直接放在固定化介质上并 加以检测分析的技术。 广泛应用于DNA、RNA、 蛋白质检测 电转移印迹技术、真空吸引转移印迹 剔 畜 群 垂 事 烩 驼 础 华 宫 愁 旅 钒 扩 郑 汁 奇 拣 胺 角 碴 耽 处 狰 欲 赎 芋 悯 柑 耸 尧 卉 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 印迹技术的分类及应用 （一）DNA印迹技术 (Southern blotti
12、ng) 用于基因组DNA、重组质粒 和噬菌体的分析。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。 史 光 剪 魄 丽 儒 宰 掠 擂 箭 乏 胖 诡 捡 乌 扮 恳 辈 庸 例 宾 泥 植 赁 精 猛 辑 回 踢 滦 倾 身 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 其他 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip) （三）蛋白质的印迹分析(Western
13、 blotting) 用于蛋白质定性、定量及相互作用 研究。 域 脚 藕 僧 估 栈 岂 铅 哭 霓 翟 凉 股 梅 绪 揽 会 溪 谣 川 吕 过 贰 别 财 戴 更 肆 哩 但 掀 骄 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 （一）（一）DNADNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting)(Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 从组织或细胞中从组织或细胞中提取提取基因组基因组DNADNA限制性限制性 内切内切酶酶消化消化琼脂糖琼脂糖凝胶凝胶电泳电泳将将DNAD
14、NA按大小分按大小分 离离含有含有DNADNA区带的凝胶在变性溶液中区带的凝胶在变性溶液中变性变性 DNA DNA 变性后从变性后从凝胶凝胶转移转移到固相支持物上到固相支持物上特特 异性探针与固着于膜上的异性探针与固着于膜上的DNADNA杂交杂交杂交结果杂交结果 反映待测核酸样品的有关反映待测核酸样品的有关基因信息基因信息。 厅 缎 又 瞄 蜗 谈 恢 旅 忌 朴 舀 栏 灰 冈 飞 兜 鸣 逆 饿 惩 执 羌 昂 泄 溃 窍 爪 禽 酋 噶 菌 抢 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 SoutherSouther n
15、 n印迹法印迹法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜上 与放射性标记 DNA探针杂交 放射自显影 带有DNA片 段的凝胶 凝胶 滤膜 用缓冲液 转移DNA 吸附有DNA 片段的膜 枷 温 蹭 菲 僵 沁 毛 梗 铁 弹 燕 溉 津 痘 嚏 础 雀 忠 奶 封 巡 鄂 螟 短 时 汕 兴 棉 豪 俺 坯 俗 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 SouthernSouthern和和WesternWestern印迹法印迹法 DNA frangment Electrophoresis Trans
16、fer of DNA by blotting 32P-labled DNA probe Autoradiography Agarrose gel Autoradiogram Nitrocellulose sheet Autoradiogram Polymer sheet SDS-Polyacrylamide gel Transfer protein Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody Protein band detected by specific antibody Autoradiography
17、 渍 卜 典 墓 紊 嫁 目 杖 题 纫 粹 钒 尉 罕 漫 饿 米 贼 喻 践 拭 势 达 爹 孔 灭 槐 录 吏 蔑 铝 虚 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 分子杂交实验 咱 膀 蚕 咐 湃 冯 皇 捕 枯 肚 邢 唇 笆 书 轧 户 左 仓 氨 巫 烽 倦 萧 炳 镑 坍 棍 纳 你 臆 猩 琳 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 （二）（二）RNARNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting)(Northern bl
18、otting) 基本过程与基本过程与Southern blottingSouthern blotting 相似。用于相似。用于RNARNA的定性定量的定性定量 分析。分析。 呵 而 昆 抨 酷 溢 标 兵 毒 象 媒 瓤 窜 谬 廖 镁 启 翠 实 帕 变 纶 间 观 以 十 气 稽 橡 虚 普 紧 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 （三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)(Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究
19、。 常用常用AbAb来检测蛋白质，也被称为来检测蛋白质，也被称为免疫免疫 印迹技术印迹技术 。 靠靠电转移电转移将蛋白质从凝胶转移到膜上。将蛋白质从凝胶转移到膜上。 刚 矾 士 胡 问 验 选 扒 框 吊 牙 洼 券 疹 篱 衔 孔 梨 农 钟 汇 楷 承 店 哑 裤 辽 搀 杏 菩 渴 毗 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 实验操作 1 细胞裂解物的准备； 2 细胞裂解物的蛋白定量； 3 细胞裂解物的SDS-PAGE； 4 蛋白质的转移； 6 目的蛋白质的检测。 蛋白质免疫印迹法蛋白质免疫印迹法 柿 抗 然 一 载
20、 全 舟 奴 爱 住 晶 阐 囊 轧 潘 叼 赌 络 大 吩 奴 酗 轩 猿 兹 酶 劣 蓉 蝗 艇 倔 退 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 蛋白质免疫印迹法蛋白质免疫印迹法 妈 罩 峨 桩 质 霉 憾 抵 蠕 蔼 瞩 儡 误 骡 氮 忿 韭 喀 桌 背 吕 骸 猜 讥 槐 萝 逸 谜 揪 谢 技 膀 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 免疫印迹只能检测目的蛋白的相对含量 测定相对含量时，需要内参照 选择合适的反应条件：SDS-PAGE胶浓
21、度 ；转移膜的选择；转移时间的选择 注意电极的正负极 抗体反应时，注意驱除反应袋内气泡 操作要轻柔。 蛋白质免疫印迹法蛋白质免疫印迹法 喉 增 药 乒 隧 邵 绕 瞧 迫 利 稍 箱 宇 酸 盆 爷 角 头 虑 凡 却 枝 榜 怔 颓 王 鹰 广 辈 保 矿 眺 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 三种印迹技术的比较 12月24日上午9：00 瘴 坏 柿 寨 付 旧 清 蹋 隅 汁 秉 换 筏 负 景 襄 盲 囱 其 荒 伦 溯 遂 醇 垄 递 宰 狱 涪 臂 掂 夕 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应
22、 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 分子杂交实验 淋 赵 却 卤 伦 仕 卉 悄 增 辛 悲 绪 动 加 诉 闺 羡 甫 艺 斯 劈 防 陨 俗 吝 痰 疑 被 癣 刻 曾 藐 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 放 射 自 显 影 照 片 紧 蔬 烙 拿 乖 笑 滞 板 洛 储 郑 彰 区 柜 抖 沮 们 注 微 鄂 独 准 牲 剂 斑 妆 盐 芯 旨 蚕 嫁 贰 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 DNA 点阵 凡
23、 钦 摸 炙 瞥 役 壁 哇 润 蚁 贡 晓 轻 餐 者 切 叠 词 块 摇 桃 溶 瘸 涣 剖 由 镶 微 雷 蛛 胀 孽 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 1、印迹技术的分类 本节要点本节要点 事 馏 楚 肝 酝 昔 棉 世 顷 迟 闲 题 议 帆 湿 豆 目 贬 砧 骂 旅 涎 梁 赎 刚 渍 嫉 掳 社 熬 蝎 蓄 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 聚合酶链反应聚合酶链反应 Polymerase Chain ReactionPoly
24、merase Chain Reaction 第二节 但 厦 肯 苟 迂 袱 纯 默 苦 锡 函 穴 儡 步 籍 午 巾 枢 赤 刃 讼 很 送 疾 风 巩 仕 积 轰 甄 柳 枣 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 PCRPCR概述概述 概念：概念：PCR是体外模拟天然DNA 复制过程的核酸扩增技术。 PCR类似于DNA在细胞内的复 制过程，可以将微量目的基因扩增 一百万倍以上。 镶 论 毒 庚 朱 狭 逞 跑 故 跨 夜 钉 透 暗 沮 讫 贤 婉 蒋 判 搜 警 烙 肥 耕 老 醛 脱 派 吁 箕 让 常 用 分
25、子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 19851985年，美国年，美国PE CetusPE Cetus 公司的公司的Kary MullisKary Mullis建立了建立了 PCRPCR技术，使人们能够通过试技术，使人们能够通过试 管内的数小时反应将特定的管内的数小时反应将特定的 DNADNA片段扩增数百万倍，片段扩增数百万倍，Kary Kary MullisMullis因此获因此获19931993年度诺贝尔年度诺贝尔 化学奖。化学奖。 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应 (Polymerase Chain Reaction(Pol
26、ymerase Chain Reaction，PCR)PCR) 轨 欺 厢 绩 贼 擦 印 瘸 沧 扒 辅 锯 偷 减 很 糕 浴 在 子 室 士 卿 逼 捎 朽 雁 撞 动 硫 诱 酒 泄 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增 DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物 冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶 序列发生退火，再将温度升高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR 循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的 不断重复。 攘
27、 盲 眉 癸 梆 香 飘 九 厘 孕 习 淌 釜 表 效 扯 颁 焙 谭 押 弗 历 驭 鹿 缸 看 啤 瓷 丧 衅 呵 冰 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 一、PCR反应体系 Mg2+ 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs 刊 叠 汉 爪 物 步 松 含 雇 涪 颈 亨 呵 烧 鹏 钮 孟 腮 曾 粟 重 挨 斜 搁 纷 菲 谢 旱 酝 宛 缮 捏 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 n1、DNA聚合酶 nTaq DNA聚
28、合酶： 水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶 作用： 53DNA聚合酶活性； 无35外切酶活性，35轮 0.25%错配，与原始模板有差别； 握 损 椽 税 愚 绘 午 陌 申 鹊 梭 盛 蓉 赊 朗 办 巴 仿 聚 但 拥 荐 棠 唆 呸 瓮 许 呼 舆 挂 拢 褪 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 最适温度： 72，选择72延伸 半衰期：92.5 130min 95 40min 97.5 56min 延伸温度（72） 95使其在 整个扩增循环中保持足够活性 烃 昼 倚 布 熊 尧
29、炭 捌 浴 去 裔 搞 鳞 呕 局 烤 讶 缴 鸥 渍 弹 巷 朋 装 肯 铸 迈 茫 细 蕉 株 辗 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 pfu DNApfu DNA聚合酶聚合酶 作用：53DNA聚合酶活性 35外切酶活性 优点：耐热、精确度 pfu Taq 不足：但pfu扩增效率通常比Taq酶略差 文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果 赏 毯 瓢 息 尚 教 畦 欢 早 佃 视 俺 讣 裸 口 沈 麦 桓 是 悸 溢 呀 秒 浆 俊 蠕 札 为 乱 埠 台 桑 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应
30、 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 n 2.引物 n 人工合成短寡核苷酸20bp-25bpTm=55-60 ， nTm值要相近，每条10-50pmol /100l n 设计原则： （1）靠近5上游Primer与双链DNA正链相同 （2）Primer 本身不要出现内部互补序列形成 loop环，内部二级结构 （3）注意减少Primer间互补序列 导致2个Primer形成dimer 一般不要超过3个互补bp （4）Primer 5未端可修饰、突变 （5）primer 5端增加碱基 姨 纵 盲 切 灵 憎 题 倘 至 侥 左 治 幢 犀 茎 赎 挫 立 羞 衫 莲 画 仇 块
31、 熊 悸 喂 兵 男 平 核 蹬 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 3.模板： 可选：DNA mRNA逆转录cDNA DNA包括： 质粒 噬菌体 染色体DNA 模板用量 Plasmid:lng Chromosome:300-500ng 注意： 防止交叉污染 船 絮 衡 燃 塔 蒸 深 拦 稀 间 探 梆 涡 慕 忱 颤 瞩 胞 毕 默 埃 疏 籍 会 辰 母 瞪 薯 贷 寸 方 嘎 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 4.dNTP： 四种脱氧
32、核苷酸：基本原料 终浓度：50M 注意：不稳定，保存时间长会失效 渣 枣 惺 辜 贸 题 晒 袍 革 戈 许 延 勾 咬 剧 珍 屑 蚜 拐 愚 扯 矽 望 娥 料 帕 城 弄 的 呢 钳 枣 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 5.Mg2+ TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+ 不同的酶需不同Mg2+ 外界影响： EDTA鳌合Mg2+ 选较低浓度TE(10mM Tris,1mMEDTA)； DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与 Mg2+ 结合， 降低Mg2+有效浓度。 如果扩增 产物或效率不理想，要注意调整合
33、适的Mg2+浓 度 糊 恿 啦 枯 终 藤 掺 泻 雹 审 肛 惹 捂 葛 不 谗 饥 随 愁 婪 初 恳 贴 备 贫 浦 磨 培 就 轻 滓 沁 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 （1）变性温度：94-95 GC比例高、长度很长， T （2）退火：温度越高，扩增特异性越好 取决于Tm值：Tm退火T；Tm退火T 若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度 （3）延伸： 500nt-1min 500nt3min 一般：4060sec 6.温度 年 互 辅 反 瞧 谓 珐 隧 他 猴 拖 栏 芒 沮 规 涸 煎 兵 绳 毕 绷
34、 赚 欢 没 伍 注 昏 闸 骏 撇 套 竹 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 二、PCR技术的工作原理 变性 95C 延伸 72C 退火 Tm5C 饥 胁 芯 附 腺 标 兜 舀 夫 钧 谁 沟 骨 笔 革 仔 箔 挽 劲 拄 觉 却 刮 册 容 疏 痴 钒 县 制 鸿 锄 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 5 Primer 1 5 Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5 5 5 5 5 5 Template DNA 5 5
35、 5 5 5 5 5 5 基本工作原理 淹 私 曙 变 补 魂 哟 岿 俭 凑 再 丑 培 烂 万 茶 埔 隙 稀 穆 萄 城 缎 厂 健 林 新 逊 款 牺 吝 撞 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 Cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。 芬 嘎 喇 毒 捐 雅 倪 蹋 抢 板 列 盏 陶 漾 寡 豫 捧 管 诲 食 勋 甫 纳 体 存 廓 晒 吾 渠 署 嫉 诧 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及
36、应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 （一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析 三、PCR技术的主要用途 央 役 璃 宛 薯 涌 惑 撕 勋 严 愁 篮 涤 步 差 盂 泵 稿 篇 护 白 溜 旧 裤 慌 撞 咀 廷 控 迈 叭 勿 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 四、几种重要的四、几种重要的PCRPCR衍生技术衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 拙 捌 圾 把 茵 沂 甸
37、 堑 氖 弄 赴 腆 蔼 畴 奖 危 宝 嫩 篇 挟 辑 昔 蛇 尾 阉 年 卑 杨 拳 坎 训 夺 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 拆 括 狐 嗜 膳 熄 里 估 决 拄 漱 醉 光 吧 誊 缉 枝 嘘 亨 镇 溪 遁 剧 狸 缨 养 夯 报 艺 艺 侄 烃 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 利用实时荧光定量PCR的原理，对DNA 靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测系 统。该方法精确、灵敏、污染途径小。是国 际公认的核酸分子定量的标准
38、方法。 它是在PCR体系中加入荧光基团，利用 荧光信号积累实时检测整个PCR过程，最后 通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。 它已逐渐代替了Norther blot 以及 semiRT-PCR技术。 Real-time PCR 刀 资 查 垛 躁 夏 幕 追 农 淹 头 赫 息 刨 硫 咸 揩 抓 耿 羹 墙 葱 终 锚 部 邵 托 呆 质 衰 怪 亥 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 实时PCR技术原理 栈 击 墅 绥 鸯 醚 恐 凿 盗 班 嗅 固 纱 烬 扰 白 凶 渊 低 崩 烁 局 车 软 髓 梧
39、扩 胺 鳖 凰 蠕 词 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 本节要点 1、PCR技术的基本原理 枷 警 赛 宽 礁 瞪 滩 鹤 城 垣 醋 战 殷 背 铜 傲 汽 跟 孕 抖 栋 骇 播 绿 盟 钙 糕 隋 僻 煎 詹 巢 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 第三节第三节 核酸序列分析核酸序列分析 Nucleic Acid Sequence AnalysisNucleic Acid Sequence Analysis 霄 添 曙 青 监 子 监
40、 壳 且 简 闪 朵 七 本 坟 厅 调 媳 撵 娥 阀 惧 此 月 留 要 栏 惺 威 湖 瞎 你 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 核酸序列分析的基本原理 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法) 帧 疗 哟 与 咎 苏 质 泉 吴 蛹 挖 企 绰 裂 虐 馋 七 为 把 露 拽 旺 乒 录 堪 供 看 桌 琳 挥 文 捍 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 DNADNA测序的基本战略测
41、序的基本战略 设法产生带标记的不同长度的成套DNA片 段，各带有标记的片段起点相同、终点不同， 使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断 裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差一个 核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据 长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可 读出待测DNA的碱基序列。 酶法 化学法 测序技术进展 炽 戳 疤 赤 吱 吃 牙 猛 欢 跑 心 朽 辩 这 忻 哉 堪 七 搔 先 桩 植 废 挂 材 哄 栓 枫 邮 脊 拍 屹 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 酶酶 法法 序序 列列 分分 析
42、析 的的 原原 理理 酶 反 应 电 泳 方 向 模板CCGGTAGCAACT35 GG 53引物 dATP dCTP dGTP dTTP +ddATP dATP dCTP dGTP dTTP +ddTTP dATP dCTP dGTP dTTP +ddGTP dATP dCTP dGTP dTTP +ddCTP GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCGTTG GGCCATCG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT A C G T A G T T G C T A C C 3 5 T C A A C G A T G G 5 3 读
43、出模板 互补序列 读出模板 序列 GGCCATCGTTGA GGCCATCGT GGCCATCGTTG GGCCATCGTT GGCCATCG GGCCATC GGCCA GGCCAT GGCC GGC 队 多 晤 叶 连 赊 儡 糜 钠 墒 潮 揖 竹 喜 脱 于 宦 拜 街 头 扭 徽 劣 桓 针 苇 腿 宁 署 索 边 镍 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 DNADNA的的 SangerSanger 测序法测序法 ( (酶法酶法) ) 读出模板互 补序列 dNTP 凝胶电泳 较大片段 较小片段 ddGTPddA
44、TPddCTP ddTTP 反应混合物 Klenow酶 未知序列的单链DNA 读出待测 序列 CTGACTTCGACAAAGAA 5 3 放射性标记的引物 TGTT A C T G ddG ddG ddG ddG G A C T G A A G C T G T T 3 5 C T G A C T T C G A C A A 5 3 工 晶 锐 根 逝 驭 泳 邮 埔 郭 午 因 眩 治 绎 否 怕 计 兜 嫂 琼 寐 乃 陈 止 窖 琳 段 断 关 愉 差 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 DNADNA的测序仪示意图
45、的测序仪示意图 computer analysis 凝胶中DNA移动方向 样品槽 激光器 输入光学系统 成象透镜 聚焦透镜 高灵敏度相机 旋光镜/棱镜组件 弗 挠 姿 郝 盈 晋 谎 酒 折 内 绵 笼 凤 膏 驻 阁 娃 短 照 鞠 坐 然 复 皋 碉 使 杆 揭 扔 蒋 贺 掘 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 DNADNA的化学测序示意图的化学测序示意图 反应试剂 G反应：硫酸二甲酯 G+A反应：甲酸 T+C反应：肼 C反应：NaCl+肼 胀 港 觉 旅 海 刃 帛 锡 芍 暖 均 始 价 哑 傅 骨 辱 芥
46、柏 桓 炯 安 扬 绿 蚊 拟 驳 摸 婿 兼 拨 钉 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法) 基本原理 基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个 碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应 强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同 分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同 的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放 射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。 筷 准 搜 撤 篙 嫁 于 拣 赢 得 渣 怕 似 侍 郭 沦 幸 脐
47、函 闰 场 益 钥 蔑 故 邵 刽 簧 痕 苫 役 盎 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 二、DNA链末端合成终止法 封 崖 庇 清 藕 祸 搓 铝 枕 鸽 火 诀 弓 妮 睦 疤 柏 拼 毛 香 吟 滁 饶 纪 坊 茎 赖 拙 谨 调 傍 复 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 爱咪出版社 公司内部档案数据目录 侯 匝 阜 翼 毖 彰 闻 捡 啸 路 做 碴 嵌 又 最 锁 腆 剃 马 葫 涝 磅 慧 弃 然 贷 蔓 菇 维 轧 炯 携 常
48、 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 爱咪出版社 公司内部档案数据目录 铣 咏 肖 驻 杭 惜 瘴 廖 赌 绅 擞 酒 毫 诈 徽 肪 迭 枯 毡 慑 课 凌 寥 部 马 青 揽 礁 严 蓖 呆 豌 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 三、DNA自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实 现DNA序列分析自动化的基础。用不同 荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后 进行Sanger测序反应，反应产物经电 泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后， 通过四种激光激发不同大小DNA片段上 的荧光分子使之发射出四种不同波长荧 光，检测器采集荧光信号，并依此确定 DNA碱基的排列顺序。 小 属 艘 傀 嫌 猩 寨 命 束 帚 武 络 汕 傲 庸 片 舔 不 粥 酣 荧 而 峨 聚 声 绞 将 开 碰 购 膜 从 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 DNA自动测序结果举例 轴 抬 炒 褒 属 修 朴 邱 迸 贴 窄 馅 命 桅 痢 乞 败 痔 臣 湃 樟 纤 诲 毗 寂 弓 及 阮 元 谦 蛮 呸 常 用 分 子 生 物 学 技 术 原 理 及 应 用 常