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1、丹芪偏瘫胶囊中羚羊角用人工牛黄替代的初步研究 为研究丹芪偏瘫胶囊（DPC）及其羚羊角替代方（DPCAS）对脑缺血的保护作用，初步探讨人工牛黄替代羚羊角的可能性，该文采用左侧大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，将150只SD大鼠随机分为假手术组，模型组，DPC（0.246 g-kg-1-d-1）组，丹芪偏瘫胶囊去羚羊角（DPCRA，0.246 g-kg-1-d-1）组，丹芪偏瘫胶囊去羚羊角人工牛黄翻倍（DPCBD，0.246 g-kg-1-d-1）组。于第5天给药后1 h 制备MCAO模型。术后24 h，眼内眦取血，测定血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、内皮素（ET）含量。术后72 h取脑组织，氯化
2、三苯基四氮唑（TTC）染色法测定大脑梗死面积、测定脑指数。荧光定量PCR方法检测脑组织bcl-2，caspase-3，IL-1β，P-选择素，E-选择素，ICAM-1 mRNA的表达，免疫组化方法检测缺血半暗区ICAM-1，IL-1β，TNF-α，IL-6的表达。结果，与模型组比较，DPCBD和DPC组实验结果基本一致，均能明显改善脑梗死指数和脑指数（P-1-d-1）， the Danqi Piantan capsule without antelope horn （DPCRA） group （0.246 g-kg-1-d-1）， the Danqi Piant
3、an capsule without antelope horn and with double artificial bezoar （DPCDB） group （0.246 g-kg-1-d-1）. The MCAO model was prepared 1 h later after the administration on the 5th day. At 24 h after the operation， the inner canthus blood was collected to determine the serum superoxide dismutase （SOD） act
4、ivity and the endothelin （ET） content. At 72 h after the operation， the cerebral infarct size and the cerebral index were determined by TTC-staining. The fluorescent quantitative PCR method was used to detect brain Bcl-2， Caspase-3， IL-1β， P-selectin， E-selectin， ICAM-1 mRNA expressions. The mm
5、unohistochemical method was used to detect ICAM-1， IL-1β， TNF-α， IL-6 expressions in ischemic penumbra. According to the results， compared with the model group， DPCDB and DPC groups showed almost consistent results， indicating both of the two group can significantly improved cerebral infa
6、rction index and cerebral index （P。由于其中的羚羊角来自濒危动物，DPC的生产和发展面临新的课题。解决这一问题的办法，目前有化学合成、人工培殖、驯养和用其他角类替代，但均不太理想。本实验基于功效相似进行替代研究，拟用人工牛黄替代羚羊角。前期实验研究表明，DPC可以防护神经元的坏死和凋亡，明显改善中风患者的功能性自立【4】，并且能够增加中风患者的脑血流量【5】。DPC能明显降低大鼠脑缺血再灌注损伤后的脑梗死指数和脑指数，增强大鼠血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutases，SOD）的活性，降低大鼠血清内皮素（endothelin，ET）水平【6
7、】。本实验通过制备大脑中动脉栓塞导致的大鼠脑缺血再灌注模型，观察DPCBD和DPC对脑缺血大鼠脑组织形态学、氧自由基、细胞凋亡、炎症反应水平影响，从而为丹芪偏瘫胶囊中羚羊角用人工牛黄替代提供一定的实验依据。1 材料1.1 药品和试剂丹芪偏瘫胶囊（其中含黄芪甲苷 0.5 mg-g-1，羚羊角与人工牛黄用量比为11，批号 201011016，天津市石天药业有限责任公司）;丹芪偏瘫胶囊去除羚羊角，丹芪偏瘫胶囊去除羚羊角人工牛黄翻倍（天津市石天药业有限责任公司）;TTC（Sigma公司，天津联星生物技术有限公司分装）;SOD免疫组化试剂盒（南京建成生物工程研究所）;内皮素ET（北京普尔伟业生物科技有限
8、公司）;Trizol（天根生物有限公司）;SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（大连宝生物工程有限公司）;兔抗鼠多克隆抗体IL-1β（博士德）;兔抗鼠多克隆抗体IL-6（博士德）;兔抗鼠多克隆抗体TNF-α（博士德）;兔抗鼠多克隆抗体ICAM-1（博士德）;羊抗兔SABC试剂盒（博士德）;DAB显色试剂盒（天津光复）;TritonX-100（天津光复）;多聚甲醛（天津光复）;其他化学试剂均为分析纯。1.2 动物SPF级SD大鼠，雄性，体重（200±20） g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号 SCXK（京）2010-000
9、3。所有的动物都被安置在严格管制的实验室中，每天有12 h的照明，12 h的黑暗时间，温度控制在21 左右，上下浮动不超过2 ，湿度控制60%70%，适应性喂养至少1周。1.3 仪器BL-420E生物机能实验系统（安徽正华生物机能实验系统）;电热恒温干燥箱（予华仪器有限公司）;JA1003型电子天平;LD4-2A医用离心机（北京医用离心机厂）;Micro Lab300半自动生化仪（荷兰威图）;DU-530紫外分光光度计;DNA/蛋白质分析仪（美国Beckman）;Allegra-64R Centrifuge低温高速离心机（BACKMAN，美国）;ECP3000水平电泳仪（北京六一仪器厂）;PC
10、R扩增仪（480-Elmer，Branchburg，NJ）;ABI7300实时荧光定量系统（Applied Biosystems，美国）;Leica CM1850冷冻切片机（德国）;Leica DM RXA2荧光显微镜（德国）。2 方法2.1 分组与给药健康雄性SD大鼠150只，随机分为5组：假手术组、模型组、DPC组（0.246 g-kg-1-d-1）、DPCRA（0.246 g-kg-1-d-1）组、DPCBD（0.246 g-kg-1-d-1）组，各给药组每天ig给药10 mL-kg-1（蒸馏水稀释）1 次，连续5 d，假手术组和模型组给予同样体积的蒸馏水。2.2 大鼠局灶性脑缺血再灌注
11、模型制备于第5天给药后1 h造模。大鼠术前12 h禁食，10%水合氯醛（300 g-kg-1）腹腔注射麻醉，仰卧位固定。参照Heurteaux C等的方法制备左侧大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，并加以改进。2 h后轻轻提拉插线至颈内与颈外动脉分支处，予以再灌注。在缺血前、缺血过程中及再灌注过程将电极连于BL-420E生物机能实验系统中分别记录脑电图（EEG），以缺血前EEG为正常EEG，模型成功标志为EEG波幅下降到原来的25%以下，大鼠翻正反射消失而自主呼吸存在。假手术组只分离左侧颈总动脉、颈外和颈内动脉，不阻塞大脑中动脉。2
12、.3 检测指标2.3.1 神经行为学评分 参照 Zea Longa等5分制评分标准进行评分。0分：无神经缺损症状;1分：不能完全伸展对侧前爪;2分：行走时向偏瘫侧转圈;3分：行走时向偏瘫侧倾倒;4分：不能自主行走，意识受到抑制;5分：死亡（剔除）。所有动物均在规定时间处死前进行神经行为学评分。2.3.2 脑组织形态学观察和脑梗死指数测定 缺血2 h再灌注24 h后，将实验动物处死，取脑，称质量。脑组织做冠状切片，厚度为2 mm左右，切成5片。脑片置于2%TTC溶液中，37 避光孵育30 min。参照文献方法，计算脑梗死指数。脑梗死指数=苍白区质量/（苍白区质量+非苍白区质量） x100%。2.
13、3.3 脑指数测定 将实验动物处死后，取脑。剔除嗅球及小脑，用滤纸吸干水分，立即称质量，按公式计算脑指数。脑指数=脑质量/体质量。2.3.4 血清SOD活性和ET水平测定 缺血再灌注24 h后，眼内眦取血，离心取血清;用半自动生化分析仪按试剂盒说明书测定 SOD 活性，采用放射免疫分析法、按试剂盒说明书操作测定 ET水平。2.3.5 荧光定量PCR方法检测脑组织Bcl-2，Caspase-3，IL-1β，P-选择素，E-选择素，ICAM-1 mRNA的表达 将实验动物处死后，取脑。置于4 冰箱约 3 min，剥取皮质组织，放入冻存管，液氮中保存备用。脑组织加Trizol，匀浆，加氯仿
14、，离心，加入异丙醇，-20 沉淀2 h，离心，加入75%乙醇，离心，加无Rnase水，得到RNA溶液，于-70 冰箱保存。测定RNA样品260，280 nm的A。用波长260 nm处A计算样品中的RNA的浓度，计算公式为：RNA浓度（g-L-1）=A260 nmx稀释倍数x40/1 000。纯净RNA的比值应为A260/A280=2.0，若低于1.6说明有酚和/或蛋白质污染。引物合成序列见表1。mRNA反转录为cDNA方法，反应体系为5xPrimeScriptTMBuffer 2 μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix0.5 μL，Oligo dT Primer
15、（50 μm） 0.5 μL，Radom 6 mers（100 μm） 0.5 μL，总RNA 400 ng，RNase Free H2O至10 μL。反应条件为37 15 min;85 5 s。实时荧光定量RT-PCR实验方法：使用实时定量PCR仪，采用相对定量实验方法。反应体系为S YBR Premix Ex TapTM（2x） 12.5 μL，PCR Forward prime （10 μm） 0.5 μL，PCR Reverse primer（10 μm） 0.5 μL，ROX Reference Dye（50x） 0.5 &
16、mu;L，模板（cDNA溶液） 2 μL，dH2O 9 μL，共25 μL。2.3.6 免疫组化方法检测脑组织IL-1β，IL-6，TNF-α，ICAM-1的表达 大鼠于再灌注72 h后，用10%水合氯醛（0.03 mL-kg-1）腹腔注射麻醉，开胸经心脏灌流生理盐水，然后以4%多聚甲醛灌流固定，断头取脑，将脑组织放入4%多聚甲醛继续固定24 h，常规梯度蔗糖脱水，行连续冠状冰冻切片，片厚30 μm，室温下晾至1 h后放入-20 冰箱保存。用SABC法进行免疫组化染色，取脑组织切片加人PBS缓冲液清洗，加30%H2O2灭活内源性过氧化酶，经抗原修复
17、液微波修复;PBS漂洗3次，封闭，滴加175稀释的一抗，孵育过夜;PBS漂洗3次，滴加SABC试剂，室温30 min，PBS漂洗4次;应用DAB溶液显色，苏木素复染，系列乙醇脱水和二甲苯透明，封片，镜检，每个样本选取20个视野，计数视野下阳性细胞数。2.4 统计学处理所有数据用±s表示，采用 SPSS 18.0 统计学软件对不同组间进行单因素方差分析。3 结果3.1 神经行为学评分动物术后约2 h清醒，模型成功动物麻醉清醒后即有神经功能缺损表现。与假手术组比较，模型组与各实验组组神经行为学评分明显升高，差异非常显著（P多从成分方面进行研究，倾向于用成分相似的其他角类，如山羊角、黄
18、羊角等进行替代，但效果不是特别理想，而且为了达到类似疗效，用量往往需要用5，10倍，甚至更多倍，不便于临床使用。本实验研究出发点基于功能相似，用与羚羊角作用类似的人工牛黄进行替代研究。本实验参考丹芪偏瘫胶囊前期研究成果，选用脑缺血再灌注模型，进行了丹芪偏瘫胶囊羚羊角替代方与原方的疗效对比研究。研究表明缺氧缺血性脑损伤中，许多相互关联的过程参与了神经元损伤机制，主要包括神经元能量衰竭、氧自由基产生、兴奋性氨基酸毒性、细胞凋亡、炎症免疫反应等。急性脑缺血再灌注后，血液、中枢神经系统和内皮细胞释放各种血管活性物质如IL-1β，TNF-α等细胞因子，引起血管通透性增加和血脑屏障损
19、伤，从而形成血管源性脑水肿。实验结果显示，脑缺血2 h、再灌注72 h后，DPC和DPCBD组均能明显降低大鼠缺血再灌注损伤后的脑指数（P。Caspase-3属于IL-1β转换酶家族，是涉及细胞凋亡的蛋白质，被认为是Caspase家族介导细胞凋亡的最终执行者。因此，本实验采用荧光PCR检测2个基因的表达。实验结果显示，模型组大鼠Caspase-3表达明显高于假手术组，DPC和DPCBD组均能抑制Casepase-3的表达、进一步上调bcl-2的表达。因此，丹芪偏瘫胶囊羚羊角替代方与原方对脑缺血再灌注损伤后抑制细胞凋亡的影响效果相当。炎症反应在缺血性再灌注脑损伤中起着重要作用。免疫炎症
20、反应造成的损伤主要与黏附分子和细胞因子有关。黏附分子是由细胞产生，能介导细胞与细胞，细胞与细胞外壁质间相互接触和结合的一类分子，具有代表性的黏附分子包括能够结合P-选择素（P-selectin）、E-选择素（E-selectin）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）等。正常状态的EC和血小板表面不存在P-selectin，P-selectin为微血管EC炎症早期表达的一种黏附分子，是EC和血小板活化的标志。E-selectin可使供血区脑组织处于缺氧和断流状态，通过连锁反应导致缺血区脑组织损伤，在脑缺血再灌注损伤过程中起到了重要作用。研究发现，脑缺血再灌注时ICAM-1的表达增高与炎性细胞因子
21、如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）等有密切关系。IL-1β是脑组织中的主要形式，它不仅能够协同其他细胞因子促进B，T细胞活化，而且能够诱导其他炎性介质的产生，加强白细胞与内皮细胞的粘附，调节TNF-α，IL-6的产生。TNF-α在脑缺血早期分泌或合成的增加是脑梗死形成的主要原因，它具有增加血管内皮细胞的通透性，诱导细胞黏附因子表达等作用。IL-6参与机体免疫应答和炎症反应，是急性缺血期脑损伤程度的一个标志。研究结果表明，DPC和DPCBD组均能明显抑制P-选择素，E-选择素，IL-1β，ICAM-1 mRNA的表达，并且在减少ICAM-1，IL-1β，TNF-α，IL-6的表达方面也显示出了相同的治疗作用。