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1、1,酸性磷酸酶Km及Vmax值测定清洗试管24支,2,酸性磷酸酶： 催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。 是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测指标。,一、概述,3,酶液 磷酸苯二钠 苯酚 磷酸氢二钠 folin-酚测定酚的浓度 计算出反应速度（用产物生成量/min来表示） 根据双倒数法计算出Km及Vmax,二、实验原理,4,5,6,三、实验步骤： 1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 3、制作酚标准曲线 4、S与V0关系实验 5、双倒数作图法计算Vmax和Km,7,buffer,substrate,en
2、zyme,Certain Time,blank,Stop the reaction,Color developed,8,生化实验课老师：于晓虹 实验报告请交到讲台上来 酶液稀释取上清液微升，稀释倍，用大试管装 科代表李博恒,9,1、磷酸酶原液的制备： 称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤，取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。 上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于实验。,10,2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 （目的：选取合适的反应时间）,11,加 液 程 序 表 管号 1 2 3 4 5
3、6 0 磷酸苯二钠 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 精确反应时间 3 5 10 15 20 25 碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 酶液 0.5 Folin酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin酚溶液已稀释好！ 注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始,35保温10分钟,12,结果：,以反应时间为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制反应进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初速率的时间范围。,13,3、制作酚标准曲线 （目的：可从酚标准曲线上查出A680n
4、m所相当的酚含量,并计算出反应速度（用每分钟产物生成量来表示）,14,加 液 程 序 表,35保温10分钟,15,结果：,以酚含量（mol）为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制标准曲线。,以0号管作空白，在可见光分光光度计680 nm波长处读取各管的吸光度（A680nm）。,16,4、S与V0关系实验,17,实 验 加 液 程 序 表 管号 1 2 3 4 5 6 0 磷酸苯二钠 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.50 0.50 醋酸缓冲液 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 - - 酶液 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 - 精 确 反 应 15 分 钟 35度 碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 Folin酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液 0.5 35保温10分钟 测680nm处吸光度 注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始,18,实验中需注意事项： 酶反应作用时间精确控制,19,实验结果,1、酚含量从酚标准曲线上查得 2、V0 反应初速率（mol/min）为酚含量除以酶反应时间（15分钟）。 3、双倒数作图法计算Vmax和Km,