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1、1,实验七 猪伪狂犬病PCR诊断,2,实验目的：,1、了解PCR反应的原理、方法及操作步骤； 2、掌握猪伪狂犬病毒PCR检测的方法；,实验内容：,1、讲述PCR反应的原理、方法及操作步骤， 2、猪伪狂犬病毒PCR检测。,3,什么是PCR？,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。,一、PCR反应的原理、方法及操作步骤,4,PCR原理,PCR是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人
2、为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。高温变性，低温退火，适温延伸等步反应循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。,5,PCR原理,PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适Buffer等条件下，用耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的反复循环 （2530次）过程，使目的DNA呈指数扩增 。,6,反应程序,变性：93-94 2min 变性：93-94 30s 复性：55-65 30s
3、 延伸：72 30s 延伸：72 2min,35个循环,7,PCR原理,Sample denaturatation Primer annealing Primer extension,8,PCR product,9,标准的PCR反应体系,10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul,10,11,酶及其浓度,目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2
4、.5U（指总反应体积为100 ul时） 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,12,引物,引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增,13,引物在线设计网址：,http:/www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/ primer/primer3_www.cgi,14,15,16,PCR产物分析 凝胶电泳分析法 可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。 同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。,17,二 猪伪狂犬病毒感染PCR检测-试剂盒,18,19,使用方法,20,注意事项：,21,作业,1、叙述PCR反应的原理、操作方法及注意事项。 2、叙述猪伪狂犬病毒感染PCR检测的方法及结果判定。,