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1、PCR,PCR（Polymerase Chain Reaction)技术即聚合酶链式反应，又称DNA体外扩增技术。 1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明，荣获1993年度诺贝尔化学奖。,DNA半保留复制的机理； 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质。,PCR的基本原理,PCR扩增体系,模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可以是细菌、组织样品等。 引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定扩增产物长度。 DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动PCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。 缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和
2、离子强度，为DNA聚合酶提供最佳工作环境。 脱氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本组成元件，包括dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP。 Mg2+、K+、增强剂,1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（95，30s）。 2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（45 65，30s） 。 3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（ 72，30 60s ）。,PCR的基本原理,高温变性,低温退火,中温延伸,理论：2n递增（n为循环次数），如果扩增30循环，目标DNA可增加230也就是109倍。 实际：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐
3、由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106 107。,PCR扩增曲线,1.早期（E期）:引物在单链DNA模板上搜索互补序列 ，并与特定位点杂交。 2.中期（M期）：扩增反应顺利进行，产物呈指数型增长。 3.晚期（L期）：平台期，DNA聚合酶过度损耗或者产物的抑制。,PCR扩增条件,循环,PCR反应条件 94 5min 94 30s 56.2 30s 72 30s 72 7min 4 ,PC1-P20： 模板：基因组DNA；产物：506bp,举个例子,PCR体系（10 L） 模板：1 L 上游引物：0.2 L 下游引物：0.2 L Easy Taq 酶：0.1 L
4、 Easy Taq Buffer：1 L dNTP：0.8 L ddH2O：6.7 L,30个循环,1.避免PCR试剂的污染 2.最适合的反应条件 3.设置对照组： PCR空白对照：在反应体系中剔除反应模板。 PCR阴性对照：即反应体系中用无关的基因片段代替目的模板。 PCR阳性对照：即反应体系中以已知能够成功进行特异性扩增的模板。,PCR的注意事项,1.为什么完全没有PCR扩增产物？ 试剂质量问题或者加样时出错，导致反应体系不完整。 聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。 PCR仪温度控制不精确。 模板DNA发生降解。 引物或反应温度设计不合理 靶片段GC含量过高或扩增对象长,常见问题,2.
5、为什么出现多条非特异性条带？ 反应体系被污染。 引物特异性差。 退火温度不合适。,常见问题,3.为什么PCR产物很少？ 聚合酶活性过低。 循环次数偏低。 模板DNA浓度过低。,常见问题,4.为什么PCR产物出现片状拖尾？ DNA聚合酶过多或酶活性差。 dNTP和Mg2+浓度过高。 退火温度过低，PCR循环数偏多。 模板DNA用量过大或模板DNA不纯。 引物特异性差、引物间形成二聚体导致非特异扩增。,常见问题,普通PCR仪,温度梯度PCR仪,实时荧光定量PCR仪,引物设计,为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。 引物是PCR特异性反应的关键，同时也与PCR扩增的效率密切相
6、关。 引物设计的最重要的原则：最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,引物设计的目的,1、引物应具有足够的特异性。 如果需要从基因组等较复杂的模板中扩增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列的非特异性。 引物与非特异序列的同源性不超过70%或有连续8个互补碱基。 NCBI Primer BLAST,引物设计的基本原则,2、避开易形成二级结构的模板序列区域。 分子内互补、发夹结构、分子间互补。 二级结构会增加引物与模板杂交以及PCR的困难，因此要尽可能避开这种序列区域。 用有关软件预测mRNA的稳定二级结构。,引物设计的基本原则,3
7、、引物长度一般为18-30个碱基之间。 引物长度与反应的特异性和解链温度成正相关。 过短：扩增特异性下降 过长：引物自身形成二级结构，以及引物二聚体。,引物设计的基本原则,4、G+C含量一般为40%-60% 引物的碱基组成也会对引物的解链温度产生影响。 G+C含量过低：引物解链温度低，引物易于从模板上解离。 G+C含量过高：引物解链温度高，易与非特异性序列杂交，出现非特异性扩增条带。,引物设计的基本原则,5、Tm值之差应小于1，最适退火温度在55-60。 一对引物的Tm值差过大可直接导致PCR扩增效率下降或失败。 对于20bp左右的引物： Tm（）=2（A+T）+4（G+C） 一般情况下，PC
8、R的最佳退火温度比引物Tm值低5左右。,引物设计的基本原则,6、引物中四种碱基最好是随机分布的 避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。特别是引物的3端不应有连续3个G或C，否则会使引物在G+C富集序列区域产生错配，降低扩增的特异性。,引物设计的基本原则,7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身互补发夹结构 引物之间互补二聚体 引物自身连续互补碱基不应超过3个，引物之间连续互补碱基不应超过4个，尤其避免3端的互补重叠。,引物设计的基本原则,8、引物的5端可以修饰，3端不可以修饰。 引物的5端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性。如：加酶切位点、标
9、记生物素、引入点突变等。 由于延伸是从3端开始的，所以不能进行任何修饰。,引物设计的基本原则,9、引物的3端不可以A结尾。 引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端最好选择T。,引物设计的基本原则,10、引物3端要避开密码子的第3位。 如扩增序列位于基因编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。,引物设计的基本原则,1、避免重复碱基，尤其是G。 2、引物退火温度在58-60之间。3、G
10、+C为30-80%。 4、3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C。 5、引物的产物大小一般在80-250bp之间；80-150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。,Real-Time PCR引物设计原则,6、要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。 7、Real-Time PCR引物的扩增产物应跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，以避免基因组DNA污染影响。,Real-Time PCR引物设计原则,Primer Premier 5.0 Oligo 6 Primer 3（在线） Primer-BLAST（在线）,引物设计常用软件,粘贴模板序列,引物搜索,引物位置,产物大小,引物
11、长度,Oligo,Primer BLAST,逆转录PCR,由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR），由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。,逆转录PCR的原理,逆转录PCR的原理,逆转录PCR的反应体系,1、模板RNA 2、逆转录酶 3、逆转录引物,93-96，较高的温度变性更快更彻底，尤其是对富含G+C的靶序列而言。,退火温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。退火温度可以通过计算推断，通常采用温度梯度PCR的方法进行摸索。,45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2
12、 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M,PC1-P20 退火温度摸索,延伸的温度通常为所以DNA聚合酶的最适工作温度，一般为72；延伸的时间主要取决于目的片段的大小，不同种类的聚合酶的合成效率也不同，因此还与DNA聚合酶的种类有关。 Easy Taq：1-2kb/min TransStart Taq:1-2kb/min FastPfu: 2-4kb/min,循环数： 在其他参数都已优化的条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度。一般情况下30-35个循环即可。 循环数太多：会增加非特异扩增产物的数量和复杂性。 循环数太少：PCR产量太低。,逆转录引物： （1）随机六聚核苷酸引物
13、 仅长6个核苷酸，每个核苷酸位点上随机加入4中不同的脱氧核苷酸，因此是46中不同引物的集合体。 所有RNA分子均可以充当模板，合成的cDNA中有96%来自rRNA。,逆转录引物： （2）Oligo（dT） 仅由dTTP构成，长度一般为18-24个核苷酸。 识别mRNA的3端poly（A）尾，因此仅mRNA可被逆转录。,逆转录引物： （3）特异性引物 能与目标RNA碱基序列互补的寡核苷酸引物，仅产生待分析基因的cDNA。,半定量 RT-PCR,基本概念,半定量RT-PCR（semi-quantitatie reverse transcription and polymerase Chain re
14、action ,SqRT-PCR）是常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。 定量RT-PCR（quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,qRT-PCR）是在用一步法或两步法，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,灰度值（IOD值） 用凝胶成像系统自带的分析软件分析目的条带的平均密度值，也称为灰度值。是density
15、和area的乘积。 平台效应 PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物-模板/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。 管家基因 持家基因(house-keeping genes)：又称管家基因，是指所有细胞中均要表达的一类基因,其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受
16、其他机制调节。,基本原理,PCR扩增反应是酶促反应，遵循酶促动力学原理，开始的循环内扩增产物呈指数积累，产物与模板呈线性关系。半定量RT-PCR技术正是利用产物与模板量的这一线性关系，通过扩增产物来对比总RNA中目的基因的表达。,基本流程,注意的问题,RNA的提取 做RT前必需测RNA浓度，常用500ng或1ug。 A260/A280和A260/A230 A260/A280在1.8-2.0时，认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，当用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。 A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物
17、、盐（胍盐）等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。 如果RNA样品的260/280=1-1.5, 260/230=1-1.5，那么污染原因就应该考虑是酚残留。 如果RNA样品的260/280=2，260/2301，那么污染原因就应该考虑是胍盐残留。,注意的问题,RNA的电泳图谱 一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是如果仅仅是为了检测RNA的质量，用普通的琼脂糖胶就可以了。 电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA 的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，R
18、NA的质量是好的。,注意的问题,注意的问题,引物设计 所设计引物的扩增效率和特异性要好，一般选择在基因的cds区域设计引物，在可能的情况下将PCR引物置于基因的不同外显子上以消除基因和mRNA的共线性。,注意的问题,注意的问题,内参的选择 为了客观地比较不同样本中目标基因表达量的相对多少，消除由于反转录时总RNA浓度差异造成的误差，要选择合适的Control基因。经常用于RT-PCR法的Control有：GAPDH、-actin、18S rRNA、28S rRNA等,注意的问题,同管扩增或异管扩增的选择 同管扩增的优点：保证扩增效率一致。 缺点：两种基因相互竞争，会影响扩增的进程。 分管扩增的
19、优点：保证每个基因的扩增进程优化。 缺点：扩增效率不能保证一致。,注意的问题,注意的问题,PCR循环数的确定 最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。 actin和GAPDH28-30，否则增加模板量,注意的问题,注意的问题,其他 扩增条件固定（时间） 循环数、循环时间、变性时间、退火和延伸、升降温的速度 体系固定（PCRmix） dNTPs、引物、反应模板、DNA聚合酶 PCR仪固定 凝胶浓度 EB浓度 梳子的选择 扫胶（曝光）,注意的问题,结果分析,将要比较的两个样品的内参调成一样的亮度； 根据扩增内参时加入的cDNA量，进行目标基因的PCR扩增；
20、 电泳扫描后，计算灰度值，先用一个标本的目标和内参进行比较，然后用这个相对值再去和其他你所要比较的平行组进行比较，一般每组3个样本以上。,结果分析,实时荧光定量PCR技术介绍 (Real time Quantitative PCR),实时荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量PCR 原理 实时原理,常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循
21、环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,实时荧光定量PCR原理定量原理,介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值,如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析,实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线,实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值,荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光
22、信号超过域值,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性,实时荧光定量PCR 原理 - 标准曲线,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beac
23、on,实时荧光定量PCR 原理 - DNA 产物的荧光标记,实时荧光定量PCR 方法 1 -SYBR Green 法,SYBR Green 法 工作机理,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理,实时荧光定量PCR 方法 2 -Taqman探针法,实验方法,Real Time PCR严格上可以区分为DNA起始的Real Time PC
24、R和RNA起始的Real Time RT-PCR。,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,SYBR Green 法 融解曲线分析,Cycle number,SYBR Green 法 定量原理,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少 Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,SYBR Green 法 -引物设计,SYBR Green 法 -PCR反应的建立,反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的
25、浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同,SYBR Green 法 -PCR反应性的确认,SYBR Green 法 -PCR条件优化,SYBR Green 法 优缺点,荧光定量PCR的解析方法绝对定量,确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,荧光定量PCR的解析方法绝对定量,荧光定量PCR的解析方法相对定量,荧光定量PCR的解析方法,荧光定量PCR的解析方法相对定量,荧光定量PCR的解析方法相对定量,荧光定量PCR的解析方法相对定量,对于双标准曲线法，比较适合于样
26、本量不大，但研究的基因较多的客户，这样对不同基因条件优化相对Delta-delta Ct法更为简单。,荧光定量PCR的解析方法相对定量,荧光定量PCR的解析方法,Comparative Delta-delta Ct法的特点 1.Comparative Delta-delta Ct法的一大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 2.每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。 用Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。,荧光定量PCR的解析方法相对定量,荧光定量PCR的解析方法相对定量,2-Ct法,谢谢！,